Un modelo de ratón de cicatrices hipertróficas similares a las humanas impulsadas por mecanotransducción

Resumen

Este protocolo explicará cómo establecer un modelo murino de cicatrización hipertrófica que aumente la señalización de mecanotransducción para simular una cicatrización similar a la humana. Este método consiste en aumentar la tensión mecánica a través de una incisión en cicatrización en un ratón y utilizar un dispositivo especializado para crear tejido cicatricial excesivo y reproducible para análisis histológicos y bioinformáticos detallados.

Resumen

La cicatrización hipertrófica (HTS, por sus siglas en inglés) es un proceso anormal de cicatrización de heridas que resulta en la formación excesiva de tejido cicatricial. Durante la última década, hemos demostrado que la mecanotransducción, la conversión de estímulos mecánicos en respuestas celulares, impulsa la cicatrización excesiva de las cicatrices fibróticas. Un modelo de ratón para evaluar la cicatrización hipertrófica similar a la humana sería una herramienta esencial para examinar diversas terapias y su capacidad para reducir la cicatrización y mejorar la curación. En concreto, nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de herida murina que aumenta la tensión mecánica para promover un HTS similar al humano. Este protocolo utiliza dispositivos de carga biomecánicos, hechos de expansores palatinos modificados de 13 mm, cuyos brazos se colocan a ambos lados de la incisión y se separan gradualmente para aplicar una tensión continua a través del lecho de la herida durante la cicatrización. A lo largo de casi dos décadas de uso, este modelo ha avanzado significativamente para mejorar la eficacia y la reproducibilidad. Utilizando el modelo murino HTS, se puede inducir que las cicatrices fibróticas dérmicas significativas son histológicamente comparables a las cicatrices hipertróficas humanas. Este modelo murino proporciona un entorno para desarrollar productos biológicos implicados en el tratamiento de la HTS y las afecciones relacionadas con la mecanotransducción, como la respuesta a cuerpos extraños.

Introducción

La cicatrización de heridas, el proceso por el cual el cuerpo intenta reparar el tejido dañado y reconstruir la barrera cutánea, puede resultar en una cicatrización atípica si sus procesos de hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación son irregulares^. La cicatrización hipertrófica (HTS) es un ejemplo de cicatrización irregular de heridas, caracterizada por la deposición excesiva de matriz extracelular y tejido conectivo en el sitio de la lesión, lo que resulta en la formación de un área de tejido cicatricial agrandada ^1,2,3. Las áreas del cuerpo que se someten a estimulaciones mecánicas repetidas de estiramiento, como alrededor de las articulaciones o en la cara, son más propensas a desarrollar HTS y fibrosis 4,5,6,7,8,9,10. Nosotros y otros hemos demostrado que el estiramiento mecánico a través de un lecho de herida promueve la formación de HTS a través de la activación de las vías de mecanotransducción, la conversión de estímulos mecánicos en respuestas celulares^.

La HTS no solo implica procesos biológicos complejos, sino que también conlleva importantes desafíos sociales, médicos y económicos para las personas afectadas. Las personas afectadas pueden luchar contra la autoestima y la depresión, especialmente cuando las cicatrices están en áreas visibles como la cara y las manos 1,9,10,12. Artículos de revisión científica indican que la prevalencia de HTS varía entre 32% y 72% en Estados Unidos^10,13. La gravedad de estos problemas estéticos, especialmente en los casos de lesiones graves por quemaduras en la región facial, se ve subrayada por el creciente número de casos de trasplante facial completo para mejorar la apariencia¹⁰. Estas cicatrices también pueden causar deficiencias funcionales al restringir el movimiento ^6,14, y a menudo se requiere intervención quirúrgica para extirpar las cicatrices y restaurar la movilidad¹⁰. El costo del tratamiento con HTS puede ser sustancial, incluidos los gastos de cirugía, tratamientos, fisioterapia o incluso atención a largo plazo ^1,10. Solo en los Estados Unidos, el costo anual del tratamiento del HTS supera los $4 mil millones¹⁰.

Teniendo en cuenta la omnipresencia de la HTS y las medidas extremas tomadas para abordar sus complicaciones, las terapias convencionales (p. ej., escisión quirúrgica, inyecciones de corticosteroides y terapia con láser) siguen siendo muy variables 1,2,15,16,17. Si bien estos tratamientos pueden ofrecer alivio en algunos casos, pueden ser insuficientes debido a la naturaleza compleja de la patología cicatricial. Factores como las diferencias genéticas entre los individuos y una comprensión incompleta de los mecanismos que impulsan la HTS hacen que las estrategias terapéuticas permanezcan clínicamente insatisfactorias 18,19,20. El futuro de la terapia HTS parece estar en nuevos enfoques innovadores que se dirigen a los impulsores mecanicistas celulares de HTS, como la mecanotransducción^11,21, que hemos demostrado ampliamente que impulsa la cicatrización excesiva de cicatrices fibróticas ^{5,6,7,8,11,21,22,23,24,25}. Específicamente, habíamos desarrollado previamente un modelo murino que aumenta la tensión mecánica de la herida para promover un HTS⁹ similar al humano. Sin embargo, después de casi dos décadas de uso, el modelo ha avanzado significativamente para mejorar la eficacia y la reproducibilidad. Este protocolo permitirá a los investigadores utilizar mejor un modelo de ratón HTS actualizado y optimizado para explorar las poblaciones celulares y los impulsores detrás de la cicatrización excesiva. El objetivo general de este método es proporcionar a los investigadores un protocolo diseñado para producir cicatrices hipertróficas similares a las humanas en ratones.

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Protocolo

Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Arizona para todos los experimentos (número de control: 2021-0828). Este protocolo utiliza ratones machos C57BL/6J de 15 semanas de edad, aunque podría aplicarse a otras edades y cepas ^9,26.

1. Creación del dispositivo de carga biomecánico HTS

NOTA: La modificación de los expansores palatinos en el dispositivo HTS puede ocurrir en cualquier momento antes del experimento.

1. Tome el expansor palatino sin modificar y preséntelo en el núcleo del espacio de creación o en el núcleo de fabricación con las especificaciones de acuerdo con la Figura 1A,B.
   NOTA: Si no hay ningún espacio de creación o núcleo de fabricación disponible, continúe con los siguientes pasos.
2. Utilice una herramienta de doblado de alambre Mini Universal Bender (MUB) para modificar el expansor palatino para que se ajuste a las especificaciones de la Figura 1A,B.
3. Coloque el dispositivo plano sobre una superficie como se muestra en la Figura 1A1.
4. Doble los brazos 90° hacia arriba para los brazos superiores y 90° hacia abajo para los brazos inferiores cuando el dispositivo quede plano con el MUB como se ve en la Figura 1A2. Consulte la Figura 1A3 para ver la apariencia del dispositivo cuando descansa plano sobre una superficie, donde los brazos ahora están perfectamente paralelos con el cuerpo del dispositivo.
5. Doble cada brazo hacia atrás en la página 90° a lo largo del eje de la línea punteada como se ve en la Figura 1A4. Consulte la Figura 1A5 para ver el dispositivo después de doblarlo.

2. Depilación e incisión inicial en el postoperatorio día 0 (POD 0)

NOTA: Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía (p. ej., tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas). Prepare suturas 5-0 esterilizadas para su uso y tenga a mano un marcador quirúrgico.

1. Limpie el espacio operativo con etanol en aerosol al 70%.
2. Coloque una almohadilla térmica a 35 °C en la mesa de preparación prequirúrgica. Pega una almohadilla absorbente sobre la almohadilla térmica. Coloque otra almohadilla absorbente sobre la almohadilla anterior (para recoger el vello afeitado). Coloque el cono (o los conos) de anestesia en la almohadilla absorbente.
   NOTA: [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.
3. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano al 1-3% y flujo de oxígeno de 2 L/min hasta que los ratones respiren tranquilamente (2-3 min).
4. Inserte la nariz de cada ratón en la abertura del cono nasal, permitiendo la inhalación de anestesia compuesta por isoflurano al 1-3% con 2 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reacción a un pinzamiento del dedo del pie. Aplique ungüento lubricante oftálmico en los ojos del ratón.
5. Use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el vello del dorso en el área como se ve en la Figura 1C.
6. Aplique la pasta depilatoria con un dedo enguantado o un hisopo de algodón sobre la piel, cubriendo el área afeitada. Después de 45 s, limpie la pasta con una gasa y luego con un hisopo con alcohol. Limpie el dorso con otro hisopo con alcohol para eliminar la pasta depilatoria, dejando un parche sin pelo (Figura 1C).
   NOTA: Es fundamental usar una cantidad moderada de pasta, retirar la pasta de inmediato y limpiar el mouse después de quitar la pasta para evitar quemaduras dérmicas por la pasta depilatoria. La piel murina es delgada, lo que la hace susceptible a quemaduras químicas rápidas que pueden tener efectos perjudiciales tanto en la salud del ratón como en la calidad experimental.
7. Etiqueta la oreja del ratón para su identificación.
8. Al quitar el pelo, vuelva a colocar al ratón en la jaula para evitar una exposición excesiva al isoflurano. Supervise el mouse.
9. Retire la almohadilla absorbente superior cubierta de pelo para tener una superficie de trabajo prequirúrgica limpia.
10. Establezca un área de trabajo quirúrgico separada. Coloque una almohadilla térmica a 35 °C sobre la mesa quirúrgica. Pega una almohadilla absorbente sobre la almohadilla térmica. Coloque el cono (o los conos) de anestesia en la almohadilla absorbente.
11. Coloque un ratón en la cámara de inducción de anestesia con un 2-4% de isoflurano y un flujo de oxígeno de 2 L/min hasta que el ratón respire tranquilamente (2-3 min).
12. Saque el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en la superficie de operación. Inserte la nariz de cada ratón en la abertura del cono nasal, permitiendo la inhalación de anestesia compuesta por isoflurano al 1-3% con 2 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reacción a un pinzamiento del dedo del pie. Aplique ungüento lubricante oftálmico en los ojos del ratón.
13. Inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida en el hombro por vía subcutánea con una aguja de 21 g para el tratamiento del dolor posquirúrgico.
14. Desinfecte el dorso del ratón con tres rondas alternas de exfoliante a base de yodo/clorhexidina y un hisopo con alcohol. Con el rotulador quirúrgico y una regla, marque una línea de 2 cm en la línea media dorsal donde se realizará la incisión de espesor completo, como se muestra en la Figura 1D.
15. Use un bisturí o unas tijeras de disección (preferencia quirúrgica) para hacer la incisión de la línea media dorsal de espesor completo a través del área marcada.
    NOTA: Tenga cuidado de no cortar el tejido subyacente (por ejemplo, músculo), como se ve en la Figura 1D.
16. Usando suturas 5-0 en un patrón interrumpido simple, cierre la incisión dividiendo la herida como se muestra en la Figura 1D. Use al menos 5 suturas espaciadas uniformemente.
17. Corta una gasa Telfa en un trozo de 3 cm x 1 cm. Colóquelo en el centro de un apósito adhesivo de espuma y coloque el apósito adhesivo en el dorso del ratón de manera que la gasa cubra la incisión como se muestra en la Figura 1D. Coloque un apósito cortado por la mitad en el abdomen y envuélvalo circunferencialmente hasta que se encuentre con el vendaje dorsal.
18. Una vez completado el vendaje, coloque al ratón en una jaula estéril separada y vigílelo hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
19. Repita el procedimiento con todos los ratones, independientemente del grupo experimental. Deje que la incisión sane durante los próximos 4 días antes del siguiente paso.

3. Colocación del dispositivo de carga biomecánico HTS (POD 4)

NOTA: Limpie y autoclave los dispositivos HTS y varios juegos de instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía (p. ej., tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas, grapadora de piel, grapas de piel). Prepare las suturas 5-0 esterilizadas para su uso. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.

1. Prepare el área de la cirugía como se describe en los pasos 2.1 y 2.2.
2. Anestesiar al ratón y proporcionar analgesia siguiendo los pasos 2.11-2.13.
3. Utilice las pinzas o el destornillador de agujas para separar el vendaje del abdomen del ratón trabajando la herramienta de lado a lado contra el lado ventral. Dejando la herramienta entre la envoltura y la piel para elevar el vendaje de la piel, use unas tijeras para cortar el vendaje.
   NOTA: Tenga cuidado de no cortar la piel del ratón, arrancar el apósito o alterar la incisión en proceso de curación.
4. Limpie el dorso con un hisopo con alcohol. Examine la incisión en busca de dehiscencia de la herida o signos de infección.
5. Asegúrese de que el dispositivo HTS no esté extendido/expandido y esté en su forma más reducida, como se muestra en la Figura 1B. Cubra ligeramente los brazos del dispositivo con pegamento médico.
6. Con una mano, haga que la piel del dorso del ratón esté ligeramente tensa en la dirección transversal. Con la otra mano, coloque el dispositivo HTS en el dorso del ratón de manera que la incisión quede equidistante de cada brazo del dispositivo HTS, centrando así el dispositivo sobre la incisión. Asegúrese de que la piel entre los brazos del dispositivo HTS esté uniformemente tensa. Sostenga el dispositivo en su lugar hasta que el pegamento se haya secado (~ 30 s), como se ve en la Figura 2A.
   NOTA: Es importante mantener la piel uniformemente tensa para garantizar que se coloquen cantidades iguales de tensión en la incisión con el dispositivo. Deje las suturas intactas durante este proceso porque el proceso de colocación del dispositivo agrega tensión mecánica a la piel, lo que puede reabrir la incisión de curación. Las suturas permanecen en su lugar hasta el primer día de estiramiento para asegurar que la herida permanezca cerrada.
7. Asegure cuatro suturas alrededor de cada brazo y a través de la piel como se muestra en la Figura 2B. Durante la sutura, asegúrese de que la aguja salga de la piel hacia la incisión.
   NOTA: La inserción de la aguja desde el lado de la incisión del dispositivo a veces puede desgarrar la incisión debido a la fuerza necesaria para perforar la piel.
8. Ahora coloque tres grapas alrededor de los brazos y a través de la piel, asegurando el dispositivo HTS a la piel como se muestra en la Figura 2B.
9. Venda el ratón siguiendo los pasos 2.17 y 2.18.
10. Repita el procedimiento con todos los ratones, independientemente del grupo experimental.
    NOTA: Todos los ratones reciben la misma preparación; sin embargo, se asignan aleatoriamente en cada grupo experimental (por ejemplo, control, estiramiento) para garantizar una distribución imparcial de los ratones en el diseño experimental. En concreto, tanto los ratones de control como los de estiramiento tendrán el dispositivo unido a su dorso. Los dispositivos de los ratones de control permanecerán intactos, mientras que los ratones estirados se someterán a los siguientes pasos.

4. Estiramiento inicial del dispositivo de carga biomecánica HTS (POD 5)

NOTA: Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos (por ejemplo, tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas) antes de la cirugía. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.

1. Asigne aleatoriamente cada ratón a través de una marca auricular al grupo deseado. Para los ratones de control, simplemente retire las suturas de la incisión y cambie los apósitos de las heridas (pasos 1-6 y luego 8-9). Si lo desea, retire el dispositivo en el momento del estiramiento y tome una foto con un implemento de medición a escala para rastrear el tamaño de la cicatriz.
2. Prepare el área quirúrgica, anestesiar al ratón y retire el apósito realizando los pasos 3.1-3.4.
   NOTA: Tenga cuidado de no arrancar el vendaje ni alterar la incisión en proceso de curación. Si un brazo del dispositivo HTS se ha desprendido de la piel, péguelo ligeramente en su lugar y agregue una grapa o sutura para la piel según el tamaño del desprendimiento.
3. Retire las suturas de la herida con tijeras de disección u otro método de elección.
4. Inserte la llave del dispositivo HTS en el dispositivo y gírela para expandir el dispositivo hasta que la piel esté tensa pero sin riesgo de desgarrarla, como se ve en la Figura 2C.
   NOTA: Esta distracción inicial puede tomar alrededor de 4-8 vueltas completas de la llave, ya que la piel puede estar suelta entre los brazos del dispositivo.
5. Venda el ratón realizando los pasos 2.17 y 2.18.

5. Estiramiento posterior del dispositivo de carga biomecánica HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

NOTA: Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos (por ejemplo, tijeras de disección, bisturí, pinzas Adson, destornillador de agujas) antes de la cirugía. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión.

1. Para los ratones de control, simplemente cambie los apósitos de las heridas (pasos 1-5 y luego pasos 13-14). Si lo desea, retire el dispositivo en el momento del estiramiento y tome una foto de la cicatriz con un implemento de medición para que la escala rastree el tamaño de la cicatriz.
2. Prepare el área quirúrgica, anestesiar al ratón y retire el apósito siguiendo los pasos 3.1-3.4.
   NOTA: Si un brazo de un dispositivo HTS se ha desprendido de la piel, péguelo en su lugar y agregue una grapa o sutura para la piel según el tamaño del desprendimiento.
3. Inserte la llave del dispositivo HTS en el dispositivo y gírela para expandirlo hasta que la piel esté tensa pero sin riesgo de desgarrarla.
   NOTA: Esto puede tomar aproximadamente 4 vueltas o ~ 2 mm de distracción total. Si el dispositivo ha alcanzado la extensión máxima y no se puede extender más, realice los pasos 5.4-5.7 para quitar y volver a conectar un nuevo dispositivo. De lo contrario, venda el mouse realizando los pasos 2.17 y 2.18.
4. Si el dispositivo ha alcanzado la extensión máxima, retire el dispositivo del dorso del mouse quitando las grapas con un removedor de grapas o tijeras haciendo palanca para abrir las puntas de las grapas. A continuación, retire las suturas y retire con cuidado el dispositivo.
5. Limpie el dispositivo con un bisturí, hisopos con alcohol y toallas de papel. Remoje el dispositivo en etanol al 70% durante ~ 20 minutos para ayudar en la limpieza. Luego, use la llave para contraer el dispositivo a su forma más delgada.
6. Vuelva a conectar el dispositivo HTS siguiendo los pasos 3.5-3.8.
7. Venda el ratón siguiendo los pasos 2.17 y 2.18.

6. Recolección del tejido HTS (POD 19)

NOTA: La recolección de tejido puede tener lugar en cualquier punto del proceso. Hemos recolectado tejido después de solo 4 días de estiramiento para examinar los primeros puntos de tiempo; sin embargo, el tejido se recolecta de manera más consistente en el POD 19 (2 semanas después de que se inició la cepa). Limpie y autoclave varios juegos de instrumentos quirúrgicos (por ejemplo, tijeras de disección, bisturí, pinzas de Adson) antes de la cirugía. Para obtener fotos de la cicatriz a lo largo del tiempo, el dispositivo se puede quitar antes de cada paso de estiramiento para tomar una foto de la cicatriz antes de volver a aplicar el dispositivo y reiniciar la tensión mecánica. [Opcional] Si dispone de un extractor de humos de sobremesa, coloque el cono cerca del espacio de trabajo y encienda la succión. El extractor de humos de sobremesa puede apagarse cuando ya no se utilice el gas isoflurano.

1. Prepare el área quirúrgica, anestesiar al ratón y retire el apósito siguiendo los pasos 3.1-3.4.
2. Sacrificar al ratón por luxación cervical.
   NOTA: Tenga cuidado de no tirar de la piel y rasgar el dorso del ratón.
3. Use tijeras de disección o un removedor de grapas para la piel para quitar las grapas de la piel. Corta las suturas. Retire suavemente el dispositivo HTS, teniendo cuidado de no rasgar la piel.
4. Con un bisturí o unas tijeras, corte la piel que rodea la cicatriz HTS. Preservar la piel para el análisis histológico de la manera deseada.
   NOTA: Si la piel se va a utilizar para análisis transcriptómicos o de proteínas (por ejemplo, qPCR, Western blot, análisis de una sola célula), asegúrese de extirpar solo el tejido cicatricial HTS para minimizar la cantidad de tejido sano circundante. Esto asegurará que el análisis solo capture el tejido cicatricial.
5. Raspe los dispositivos HTS con un bisturí. Coloque los dispositivos en un vaso de precipitados con etanol al 70% para ablandar cualquier adhesivo o tejido restante.
   NOTA: Después de remojar en etanol al 70%, es posible que los dispositivos requieran una mayor limpieza, raspado y limpieza antes de esterilizarlos en autoclave.

7. Medición de la anchura media de la cicatriz

NOTA: Esto se logró con el software de análisis de imágenes ImageJ, y la información se registró en una hoja de cálculo.

1. Abra imágenes en ImageJ. Traza los bordes de la cicatriz con la herramienta polígono . Haga clic en analizar | medir para medir esta área.
   NOTA: La cicatriz se puede identificar por su decoloración y falta de folículos pilosos.
2. Mida la longitud de la cicatriz de extremo a extremo con la herramienta de segmento . Haga clic en analizar | medir para medir esta longitud.
3. Mida la longitud de 1 cm o cualquier otra unidad de longitud estandarizada en la imagen, utilizando la herramienta de segmento . Haga clic en analizar | medir para medir esta longitud.
4. Usando la hoja de cálculo, toma el Área de la cicatriz (en píxeles; px) y divídela por la Longitud de la cicatriz (longitud px ). Ese resultado da el ancho promedio de la cicatriz en píxeles.
5. Divide ese resultado por la unidad de longitud estándar medida (px longitud). El resultado será el ancho promedio de la cicatriz en la unidad de la unidad estándar de longitud (por ejemplo, cm) utilizada para el experimento.

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Resultados

Para demostrar claramente el uso efectivo del protocolo HTS e identificar resultados "positivos" exitosos, se estableció el modelo como se muestra en la Figura 3A. En el estudio representativo, hubo dos grupos: No Stretch Control (n = 6) y el grupo Mechanical Stretch HTS (n = 6) donde se indujeron niveles de tensión mecánica similares a los humanos a través de la incisión para generar un HTS, como se ve en la Figura 3B

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Discusión

El modelo de ratón HTS es un método rentable y altamente reproducible para inducir HTS a través de la mecanotransducción y desarrollar posibles terapias. Si bien existe una curva de aprendizaje inicial para usar el modelo de manera efectiva, el protocolo puede, con la práctica, ser realizado por cualquier investigador sin capacitación quirúrgica. El uso de este modelo permite a los investigadores comprender mejor la formación de HTS y el papel de la mecanotransducción en la cica...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL PYREX Griffin beaker	Milipore Signma	CLS1000100
Aesculap Exacta mini trimmer	Aesculap
AutoClip System	Fine Surgical Instruments	12020-00
BD brand isopropyl alcohol swabs	Fisher Scientific	13-680-63
Buprenorphine SR (0.5 mg/mL)	Buprenex, Indivior Inc.	12496-0757-1
C57/BL6 females (6–8 weeks old)	The Jackson Laboratory	000664
Covidien sterile gauze	Fisher Scientific	2187
Covidien TelfaTM non-adherent pads	Fisher Scientific, Covidien	1961
Dental surgical ruler	DoWell Dental Products	S1070
Depilatory cream (Nair Hair Remover Lotion)	Church&Dwight, CVS	339823
Ethanol 70% solution	Fisher Scientific	64-17-5
Excel	Microsoft Cooperation	Microsoft.com	software program
ImageJ	ImageJ, Wayne Rasband	imagej.net	software program
Inhalation anesthesia system	VetEquip	922130
Iris scissors 4½ in. stainless	McKesson	43-2-104
Isoflurane, USP	Dechra Veterinary Products	17033-094-25
Kaka industrial MUB-1	Kaka Industrial	173207	Only necessary if there is no maker space or fabrication shop available
Leone Rapid Palatal Expander- 13 mm	Great Lakes Dental Technologies	125-004	The key necessary to expand and cotnract the device will come with this product in the box
Liquid repellent drape 75 x 90 cm with adhesive hole 6 x 9 cm	Omnia S.p.A.	12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 Rx	Medequip Depot D707N, Fisher Scientific	NCO835822
Needle holder 5 in. with serrated jaws	McKesson	43-2-842
Prism 9	GraphPad Holdings, LLC	graphpad.com	software program
Puralube ophthalmic ointment	Dechra, NDC	17033-211-38
R studio Desktop	RStudio PBC	rstudio.com	software program
Surgical skin marker	McKesson	19-1451_BX
Tegaderm, 3 M	VWR	56222-191	foam adhesive dressing
Thermo-peep heating pad	K&H, Amazon
Tissue forceps 4¾ in. stainless 1 x 2 teeth	Mckesson	43-2-775
Vetbond (3 M)	Saint Paul, MN	1469SB