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Method Article
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Questo protocollo spiegherà come stabilire un modello murino di cicatrici ipertrofiche che aumenta la segnalazione di meccanotrasduzione per simulare cicatrici simili a quelle umane. Questo metodo prevede l'aumento della tensione meccanica attraverso un'incisione di guarigione in un topo e l'utilizzo di un dispositivo specializzato per creare un tessuto cicatriziale riproducibile ed eccessivo per analisi istologiche e bioinformatiche dettagliate.
La cicatrizzazione ipertrofica (HTS) è un processo anomalo di guarigione delle ferite che provoca un'eccessiva formazione di tessuto cicatriziale. Nell'ultimo decennio, abbiamo dimostrato che la meccanotrasduzione, la conversione di stimoli meccanici in risposte cellulari, guida l'eccessiva guarigione delle cicatrici fibrotiche. Un modello murino per valutare le cicatrici ipertrofiche simili a quelle umane sarebbe uno strumento essenziale per esaminare varie terapie e la loro capacità di ridurre le cicatrici e migliorare la guarigione. In particolare, il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di ferita murina che aumenta lo sforzo meccanico per promuovere HTS simile a quella umana. Questo protocollo utilizza dispositivi di carico biomeccanico, realizzati con espansori palatali modificati da 13 mm, i cui bracci sono posizionati su entrambi i lati dell'incisione e distratti in modo incrementale per applicare una tensione continua sul letto della ferita durante la guarigione. Nel corso di quasi due decenni di utilizzo, questo modello è stato notevolmente migliorato per migliorare l'efficacia e la riproducibilità. Utilizzando il modello HTS murino, è possibile indurre cicatrici fibrotiche dermiche significative ad essere istologicamente paragonabili alle cicatrici ipertrofiche umane. Questo modello murino fornisce un ambiente per lo sviluppo di farmaci biologici coinvolti nel trattamento dell'HTS e delle condizioni correlate alla meccanotrasduzione, come la risposta da corpo estraneo.
La guarigione delle ferite, il processo mediante il quale il corpo tenta di riparare il tessuto danneggiato e ricostruire la barriera cutanea, può portare a una guarigione atipica se i suoi processi di emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento sono irregolari1. La cicatrizzazione ipertrofica (HTS) è un esempio di guarigione irregolare delle ferite, caratterizzata da un'eccessiva deposizione di matrice extracellulare e tessuto connettivo nel sito della lesione con conseguente formazione di un'area di tessuto cicatriziale allargata 1,2,3. Le aree del corpo che subiscono ripetute stimolazioni meccaniche di stiramento, come intorno alle articolazioni o sul viso, sono più inclini a sviluppare HTS e fibrosi 4,5,6,7,8,9,10. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'allungamento meccanico attraverso un letto di ferita promuove la formazione di HTS attraverso l'attivazione di vie di meccanotrasduzione, la conversione di stimoli meccanici in risposte cellulari 9,11.
L'HTS non solo coinvolge processi biologici complessi, ma comporta anche notevoli sfide sociali, mediche ed economiche per le persone colpite. Gli individui colpiti possono lottare con l'autostima e la depressione, specialmente quando le cicatrici si trovano in aree visibili come il viso e le mani 1,9,10,12. Articoli di revisione scientifica indicano che la prevalenza di HTS varia tra il 32% e il 72% negli Stati Uniti10,13. La gravità di questi problemi estetici, soprattutto nei casi di gravi ustioni nella regione facciale, è sottolineata dal numero crescente di casi di trapianto facciale completo per migliorare l'aspetto10. Queste cicatrici possono anche causare menomazioni funzionali limitando il movimento 6,14 e spesso è necessario un intervento chirurgico per asportare le cicatrici e ripristinare la mobilità10. Il costo del trattamento HTS può essere sostanziale, comprese le spese per chirurgia, trattamenti, terapia fisica o persino assistenza a lungo termine 1,10. Solo negli Stati Uniti, il costo annuale del trattamento dell'HTS supera i 4 miliardi di dollari10.
Considerando la pervasività dell'HTS e le misure estreme adottate per affrontare le sue complicanze, le terapie convenzionali (ad esempio, l'escissione chirurgica, le iniezioni di corticosteroidi e la terapia laser) rimangono altamente variabili 1,2,15,16,17. Sebbene questi trattamenti possano offrire sollievo in alcuni casi, possono essere insufficienti a causa della natura complessa della patologia cicatriziale. Fattori come le differenze genetiche tra gli individui e una comprensione incompleta dei meccanismi che guidano l'HTS fanno sì che le strategie terapeutiche rimangano clinicamente insoddisfacenti 18,19,20. Il futuro della terapia HTS sembra risiedere in nuovi approcci innovativi che mirano ai driver meccanicistici cellulari dell'HTS, come la meccanotrasduzione11,21, che abbiamo ampiamente dimostrato di guidare l'eccessiva guarigione delle cicatrici fibrotiche 5,6,7,8,11,21,22,23,24,25. In particolare, avevamo precedentemente sviluppato un modello murino che aumenta lo sforzo meccanico della ferita per promuovere HTS9 simile a quello umano. Tuttavia, dopo quasi due decenni di utilizzo, il modello è stato notevolmente avanzato per migliorare l'efficacia e la riproducibilità. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di utilizzare al meglio un modello murino HTS aggiornato e ottimizzato per esplorare le popolazioni cellulari e i fattori alla base dell'eccessiva cicatrizzazione. L'obiettivo generale di questo metodo è fornire ai ricercatori un protocollo progettato per produrre cicatrici ipertrofiche simili a quelle umane nei topi.
Per tutti gli esperimenti è stata ottenuta l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università dell'Arizona (numero di controllo: 2021-0828). Questo protocollo utilizza topi maschi C57BL/6J di 15 settimane, sebbene possa essere applicato ad altre età e ceppi 9,26.
1. Creazione del dispositivo di carico biomeccanico HTS
NOTA: La modifica degli espansori palatali nel dispositivo HTS può avvenire in qualsiasi momento prima dell'esperimento.
2. Depilazione e incisione iniziale al giorno 0 postoperatorio (POD 0)
NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciatore ad ago). Preparare i punti di sutura sterilizzati 5-0 per l'uso e tenere a portata di mano un pennarello chirurgico.
3. Posizionamento del dispositivo di carico biomeccanico HTS (POD 4)
NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave i dispositivi HTS e diversi set di strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciaago, cucitrice cutanea, graffette cutanee). Preparare le suture sterilizzate 5-0 per l'uso. [Facoltativo] Se è disponibile un estrattore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.
4. Tratto iniziale del dispositivo di caricamento biomeccanico HTS (POD 5)
NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciaago) prima dell'intervento chirurgico. [Facoltativo] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.
5. Successivo allungamento del dispositivo di carico biomeccanico HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)
NOTA: Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson, cacciaago) prima dell'intervento chirurgico. [Facoltativo] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione.
6. Prelievo del tessuto HTS (POD 19)
NOTA: Il prelievo del tessuto può avvenire in qualsiasi momento del processo. Abbiamo raccolto il tessuto dopo soli 4 giorni di allungamento per esaminare i primi punti temporali; tuttavia, il tessuto viene raccolto in modo più coerente al POD 19 (2 settimane dopo l'inizio del ceppo). Pulire e sterilizzare in autoclave diversi set di strumenti chirurgici (ad es. forbici da dissezione, bisturi, pinze Adson) prima dell'intervento chirurgico. Per ottenere foto della cicatrice nel tempo, il dispositivo può essere rimosso prima di ogni fase di allungamento per scattare una foto della cicatrice prima di riapplicare il dispositivo e ricominciare lo sforzo meccanico. [Facoltativo] Se è disponibile un aspiratore di fumi da banco, posizionare il cono vicino all'area di lavoro e accendere l'aspirazione. L'aspiratore di fumi da banco può essere spento quando il gas isoflurano non viene più utilizzato.
7. Misurazione della larghezza media della cicatrice
NOTA: Questa operazione è stata eseguita con il software di analisi delle immagini ImageJ e le informazioni sono state registrate su un foglio di calcolo.
Per dimostrare chiaramente l'uso efficace del protocollo HTS e identificare i risultati "positivi" di successo, è stato stabilito il modello come mostrato nella Figura 3A. Nello studio rappresentativo, c'erano due gruppi: No Stretch Control (n = 6) e Mechanical Stretch HTS group (n = 6) in cui livelli di sforzo meccanico simili a quelli umani sono stati indotti attraverso l'incisione per generare un HTS, come mostrato nella Figura 3B
Il modello murino HTS è un metodo economico e altamente riproducibile per indurre HTS tramite meccanotrasduzione e sviluppare potenziali terapie. Sebbene esista una curva di apprendimento iniziale per utilizzare efficacemente il modello, il protocollo può, con la pratica, essere eseguito da qualsiasi ricercatore senza formazione chirurgica. L'utilizzo di questo modello consente ai ricercatori di comprendere meglio la formazione di HTS e il ruolo della meccanotrasduzione nella guarigion...
Gli autori non hanno interessi concorrenti o altri conflitti associati ai contenuti di questo articolo.
Questo lavoro è stato supportato dal Center for Dental, Oral, and Craniofacial Tissue and Organ Regeneration Interdisciplinary Translational Project Awards, sostenuto dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (U24 DE026914) (G.C.G) e dalla Plastic Surgery Foundation Translational Research Grant (837107) (K.C.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mL PYREX Griffin beaker | Milipore Signma | CLS1000100 | |
Aesculap Exacta mini trimmer | Aesculap | ||
AutoClip System | Fine Surgical Instruments | 12020-00 | |
BD brand isopropyl alcohol swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | |
Buprenorphine SR (0.5 mg/mL) | Buprenex, Indivior Inc. | 12496-0757-1 | |
C57/BL6 females (6–8 weeks old) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Covidien sterile gauze | Fisher Scientific | 2187 | |
Covidien TelfaTM non-adherent pads | Fisher Scientific, Covidien | 1961 | |
Dental surgical ruler | DoWell Dental Products | S1070 | |
Depilatory cream (Nair Hair Remover Lotion) | Church&Dwight, CVS | 339823 | |
Ethanol 70% solution | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
Excel | Microsoft Cooperation | Microsoft.com | software program |
ImageJ | ImageJ, Wayne Rasband | imagej.net | software program |
Inhalation anesthesia system | VetEquip | 922130 | |
Iris scissors 4½ in. stainless | McKesson | 43-2-104 | |
Isoflurane, USP | Dechra Veterinary Products | 17033-094-25 | |
Kaka industrial MUB-1 | Kaka Industrial | 173207 | Only necessary if there is no maker space or fabrication shop available |
Leone Rapid Palatal Expander- 13 mm | Great Lakes Dental Technologies | 125-004 | The key necessary to expand and cotnract the device will come with this product in the box |
Liquid repellent drape 75 x 90 cm with adhesive hole 6 x 9 cm | Omnia S.p.A. | 12.T4362 | |
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 Rx | Medequip Depot D707N, Fisher Scientific | NCO835822 | |
Needle holder 5 in. with serrated jaws | McKesson | 43-2-842 | |
Prism 9 | GraphPad Holdings, LLC | graphpad.com | software program |
Puralube ophthalmic ointment | Dechra, NDC | 17033-211-38 | |
R studio Desktop | RStudio PBC | rstudio.com | software program |
Surgical skin marker | McKesson | 19-1451_BX | |
Tegaderm, 3 M | VWR | 56222-191 | foam adhesive dressing |
Thermo-peep heating pad | K&H, Amazon | ||
Tissue forceps 4¾ in. stainless 1 x 2 teeth | Mckesson | 43-2-775 | |
Vetbond (3 M) | Saint Paul, MN | 1469SB |
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