猪腰椎导管插入手术技术，可在终端设置中连续进入鞘囊

摘要

我们提出了一种在 3 个月大的丹麦长白猪的 L4-L5 水平插入腰椎导管的技术，作为最终研究方案的一部分，能够从鞘囊连续输注或脑脊液采样。

摘要

由于猪和人类中枢神经系统 （CNS） 之间的解剖学和生理学相似性，猪越来越多地被用作药理学 CNS 研究的大型动物模型。然而，由于脊髓棘突的倾斜方向和有限的椎板间隙，通过传统的腰椎穿刺技术获取大型猪品种的脑脊液 （CSF） 可能具有挑战性。因此，本研究详细描述了一种插入腰椎导管在猪 L4/L5 水平连续 CSF 采样的开放外科手术。在定位猪并确定解剖标志后，制作背侧中线手术切口以暴露棘突。通过推进导引针，脊髓导管插入椎管的鞘囊内，同时保持脊柱的骨骼结构完好无损。这种方法允许连续输注到猪鞘膜囊中或从中取样，出血或脑脊液泄漏最少。该程序简单、省时且可在不同的实验设置中重现，为各种临床前研究提供了巨大的潜力，包括药代动力学研究、手术培训和脊髓损伤模型。

引言

当道德或实际限制阻止使用人类受试者来研究疾病或测试手术方法时，动物模型是必不可少的。虽然啮齿动物因其低成本而被广泛使用，但它们的转化相关性受到与人类的显著差异的限制¹。然而，与啮齿动物相比，猪具有多项优势，包括与人类的解剖学和生理学相似性——尤其是在 CNS 研究的背景下 ^1,2。犬类模型历来是 CNS 研究的实验模型，但近年来道德考虑限制了狗的使用³。此外，猪器官的大小与人类相当，增强了它们在外科研究和程序培训中的用途⁴。猪的 CNS 和脊柱与人类的 CNS 和脊柱非常相似，在大脑和脊髓的结构和功能上具有相似之处 ^1,5,6。重要的是，猪的脊柱和椎管的尺寸使其适用于各种临床前研究 ^7,8，包括手术程序训练 ^9,10、药物穿透 11,12,13 和脊髓损伤 ¹⁴。

在许多实验设置中，获取猪模型中的 CSF 至关重要。虽然腰椎穿刺提供了一种单一 CSF 取样或鞘内给药的方法，但反复腰椎穿刺是不切实际的。它们存在椎管内血肿、神经损伤和脑脊液血液污染的潜在风险。在人类患者中，脊髓微导管通常用于动脉瘤性蛛网膜下腔出血的连续腰椎 CSF 引流，并且由于大小相似，应该同样适用于猪的连续 CSF 采样。然而，猪的物种特异性解剖学差异对 CSF 通路提出了独特的挑战。例如，重叠的椎板、骨化韧带和丰富的硬膜外脂肪组织的存在使传统的经皮腰椎穿刺技术不太可靠¹⁵。在哥廷根小型猪中，采用了一种微创经皮方法，可以进行连续 CSF 采样¹⁶。这种方法依赖于手动识别腰椎间隙，并且导管插入术本身是在没有看到导引器的情况下进行的。然而，这种技术不太适合体型较大的猪，因为椎体大小、棘突和硬膜外脂肪组织数量的解剖变化使经皮导管插入术更加困难¹⁵。因此，在较大的猪模型中，可能需要涉及脊柱暴露的更具侵入性的方法，以确保可靠的导管放置。

本手稿的目的是描述将脊髓导管插入 L4/L5 水平猪鞘膜囊的外科手术。该程序包括定位受试者、根据解剖标志规划手术切口以及在导管插入术前进入脊柱的后骨结构。

研究方案

根据丹麦动物实验检查局（许可证号 2020-15-0201-00401）的批准，受试者按照当地法规被安置。对象信息：家猪，母猪，约 40 公斤，3 个月大。

1. 受试者住房和术前禁食

1. 在手术前至少 14 天，将受试者分组在 12 小时的光照/黑暗循环中放入经批准的住房围栏中，以确保适当适应并减轻压力¹⁷。
2. 确保受试者在计划麻醉前已进行食物戒断 12 小时，以降低反流的风险。如果受试者的饮食包括苜蓿或其他类型的干草，则必须在手术前 2-3 天将其从饮食中排除，因为这会进一步延迟胃排空时间¹⁸.

2. 麻醉和监测

1. 通过肌肉注射 2 mL/10 kg 体重的氯胺酮 6.25 mg/mL、唑拉西泮 6.25 mg/mL、噻拉胺 6.25 mg/mL、布托啡诺 1.25 mg/mL 和甲苯噻嗪 6.25 mg/mL （Zoletil） 的混合物麻醉受试者。
2. 将受试者仰卧在加热毯上以支持体温调节。
3. 用 6.5 号管¹⁹ 对受试者进行插管，并根据呼气呼气末 CO₂ 浓度 6.0 kPa，用非加湿空气进行机械通气，潮气量为 8-10 mL/kg，呼吸频率为 16-22 呼吸/分钟< 6.0 kPa。
   注意：CO₂ 读数可确认插管的正确气管内位置。
4. 通过吸入 3%-4% 汽化七氟烷维持麻醉¹⁸。
5. 小心地双侧涂抹眼药膏，以避免麻醉时干燥。
6. 每 10^分钟检查 一次肌肉松弛和无睑部运动，确保足够的麻醉程度¹⁸。
7. 将带有温度计的膀胱导管通过尿道¹⁹ 插入受试者的膀胱，以监测温度并将尿液收集在合适的导尿袋中。
8. 通过经皮穿刺将外周静脉导管插入合适的浅表耳静脉，并在研究结束时将其用于连续盐水（NaCl，0.9%）输注、药物输注和安乐死。
9. 通过经皮穿刺将股动脉导管（6 Fr 片）插入右股动脉。使用此通路进行连续有创血压监测。
10. 在整个手术过程中每 5 分钟监测一次受试者的生命体征。
    注：生命体征包括脉搏、持续侵入性动脉血压、膀胱内温度和呼气末 CO₂ 浓度。

3. 动物定位

1. 将受试者置于手术台中央的俯卧位。确保受试者的脊柱笔直，以避免任何脊柱侧弯。
2. 在脊柱的腰部下方放置一个沙袋，以增加椎板之间的角度。
3. 用修剪器剃掉手术部位的毛发。
4. 以离心方式将碘溶液涂抹在手术部位。重复此过程，直到覆盖整个手术部位。
5. 将被摄体稍微倾斜至直立位置。

4. 手术器材的准备

1. 准备 材料表中列出的手术设备。

5. 确定关键的解剖标志

1. 确定受试者腰椎两侧的髂嵴，并沿着内侧的轮廓移动，直到确定骶骨（图1）。
2. 确定骶骨颅侧和 L6 棘突之间中线的椎间空间。
3. 识别 L6、L5 和 L4 的棘突（图 1、 图 2）。

6. 揭露棘突

1. 使用 24 号手术刀沿棘突 L4-L6 做一个中线切口，切开皮肤和皮下。
2. 使用单极烧灼浅静脉和小动脉的小出血。
3. 用手术沼泽擦去血液，检查是否有活动性出血;相应地使用 monopolar。
   注意：即使是轻微的出血也要停止，以避免血肿。
4. 插入手术牵开器并扩大开口。
5. 确定棘突背侧的棘上韧带。
6. 沿着棘突的外侧用单极逐渐扩大切口，直到可以看到大约 1 cm 的棘突（图3）。
   注意：如果执行该程序的人是右撇子，则应考虑跟随受试者的棘突右侧，以便以后插入导引人。
7. 识别 L4/L5 之间的棘突间韧带（图3）。
8. 检查是否有活动性出血，并相应地应用单极进行烧灼。

7. 进入鞘囊

1. 通过手动触诊确定棘突板之间的 L4/L5 椎间隙。
2. 放置导引器，其斜面和管腔朝向颅方向，与 L4/L5 椎板内空间成一定角度（图 2、 图 4、 图 5）。
3. 确保导引器保持在 30° 水平和 45° 颅倾角（图 5）。
   注意：瞄准 L4/L5 之间的椎板内空间。
4. 逐渐推进导引器，直到感觉到轻微的阻力;这代表黄韧带。
   注意：钝性阻力的感觉表明导引器被棘突停止。如果发生这种情况，请将导引器缩回 1 cm，然后以略微不同的倾斜度再次前进。
5. 施加一个坚定但非常小心的压力，并将导引器逐毫升推进黄韧带，直到感觉到突然失去阻力。
   注意：如果受试者在腰部肌肉组织或后腿表现出运动反射，那是由于与神经根的直接接触而不是麻醉不足。
6. 通过移除套管针来跟踪导引器的每一次进步，以检查可见的 CSF 流量。
7. 通过目视确认导引器在穿透黄韧带和随后的硬脑膜后从导引器流出的 CSF 来确认导引器在椎管内的正确位置。
   注意：CSF 的自发流动可能很慢。可以通过向导引器中注入无菌盐水并观察脉动来加快确认。
8. 将套管针重新插入导引器，以避免在准备导管时脑脊液过度损失。

8. 将导管插入鞘囊

1. 将导丝插入导管。
2. 从导引器上取下套管针。
3. 将包含导丝的导管插入导引器，直到感觉到轻微的阻力。
4. 从导引器远端测量 5 厘米，并用手术标记做标记。
5. 当导管推进到鞘囊中时，施加轻柔而坚定的压力，直到先前测量的标记到达导引器。
   注意：由于延髓反射，尽管被充分麻醉，对象仍可能会抽搐/移动。
6. 小心地缩回导引器，同时保持导管在其位置。
   注意：一旦导管在皮肤上方可见，请立即牢牢抓住导管，以避免在移除导引器时错位。
7. 取下导丝，同时在皮肤水平牢牢抓住导管（图 6）。
8. 将 2 mL 一次性塑料注射器连接到导管上。
9. 通过从导管抽吸 CSF 确认椎管内的位置。
10. 如果注射器中缺少 CSF，请轻轻缩回导管几毫米以恢复通畅。
11. 用胶带将脊髓导管固定在手术牵开器和皮肤上，以避免错位。

9. 脂多糖的给药

1. 将 400 μg 大肠杆菌 脂多糖 （LPS） （OH：143） 注入中心静脉片中。
2. 启动计时器。

10. CSF 采样

1. 在接下来的 24 小时内每小时获取 CSF 样本，以测量总白细胞计数、CSF-白蛋白和 CSF IgG。每个样品中最多抽取 0.5 mL 的 CSF。

11. 安乐死

1. 通过外周静脉导管推注戊巴比妥 （50 mg/kg）。
2. 观察呼吸器处的脉搏、血压和呼气末 CO₂ 浓度曲线是否平坦，以确认心脏骤停。

结果

猪的俯卧位优化了对腰椎的手术通路。使用支撑沙袋会增加相邻腰椎棘突之间的成角，从而改善椎管通路。

本研究旨在调查脑室内接种 大肠 杆菌脂多糖后脑脊液隔室内的炎症反应。共有 10 头猪接受了该程序，随后的 CSF 分析显示，平均总 CSF 白细胞从 0 小时的 30 x 10⁶/L（范围 17-39）增加到 12 小时的 19,720 x 10⁶/L （11,353-30,546），...

讨论

用于猪连续 CSF 采样的腰椎导管插入演示程序涉及几个关键步骤。首先，必须暴露正确的椎体水平，以确保成功插管的最佳条件。与人类相比，猪脊髓进一步向尾部延伸，达到 S2-S3¹⁵ 级，而人类髓圆锥终止于 L1-L2²⁰ 级。因此，在猪中进入腰腔池进行 CSF 采样更具挑战性，尤其是在脊髓占据更多鞘内空间的较高腰椎水平时。根据我们的经?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable operating table	N/A	N/A
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400mg/mL
Foley Catheter 12F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catheter with in-built thermosensor
Intravenous peripheral catheter	Avantor	BDAM381344	Size G18
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6F
Monopolar, ForceTriad System	Medtronic
Plastic Syringe, 2 mL	Becton, Dickinson and Company	300928
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthisa
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Silicone Lumbar Catheter incl. Introducer	Integra	NL8508330
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia