돼지의 요추 척추 카테터 삽입을 위한 수술 기법으로 터미널 설정에서 종골낭에 지속적으로 접근할 수 있습니다.

요약

우리는 말기 연구 프로토콜의 일환으로 3개월 된 덴마크 랜드레이스 돼지에 L4-L5 수준의 요추 척추 카테터를 삽입하여 종골낭에서 지속적인 주입 또는 CSF 샘플링을 가능하게 하는 기술을 제시합니다.

초록

돼지는 돼지와 인간의 중추신경계(CNS) 사이의 해부학적, 생리학적 유사성으로 인해 약리학적 중추신경계 연구를 위한 대형 동물 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 기존의 요추 천자 기술로 대형 돼지 품종에서 뇌척수액(CSF)에 접근하는 것은 척추돌기의 비스듬한 방향과 제한된 층간 공간으로 인해 어려울 수 있습니다. 따라서, 돼지에서 L4/L5 수준의 지속적인 CSF 샘플링을 위해 요추 척추 카테터를 삽입하는 개복 수술 절차가 이 연구에서 자세히 설명되어 있습니다. 돼지의 위치를 잡고 해부학적 랜드마크를 확인한 후, 가시돌기를 노출시키기 위해 등쪽 정중선 수술을 절개합니다. 내측 바늘을 전진시킴으로써, 척추 카테터는 척추의 뼈 구조는 그대로 유지하면서 척추관의 종골낭 내부에 삽입됩니다. 이 방법을 사용하면 출혈 또는 CSF 누출을 최소화하면서 돼지 낭으로 지속적으로 주입하거나 시료를 채취할 수 있습니다. 이 절차는 간단하고 시간 효율적이며 다양한 실험 설정에서 재현 가능하여 약동학 연구, 수술 교육 및 척수 손상 모델을 포함한 다양한 전임상 연구에 상당한 잠재력을 제공합니다.

서문

동물 모델은 윤리적 또는 실제적 한계로 인해 질병을 조사하거나 수술 방법을 테스트하기 위해 인간 피험자를 사용할 수 없을 때 필수적입니다. 설치류는 저렴한 비용으로 인해 일반적으로 사용되지만, 인간과의 상당한 차이로 인해 번역 관련성이 제한됩니다¹. 그러나 돼지는 설치류에 비해 인간과 해부학적, 생리학적으로 유사하다는 점을 포함하여 몇 가지 이점을 제공합니다 - 특히 CNS 연구의 맥락에서^{그렇습니다 1,2}. 개 모델은 역사적으로 중추신경계 연구를 위한 실험 모델로 사용되었지만, 최근 몇 년 동안 윤리적 고려로 인해 개 사용이 제한되었습니다³. 더욱이, 돼지 장기는 인간과 비슷한 크기로 인해 외과 연구 및 시술 훈련에 대한 활용도가 높아진다⁴. 돼지 중추신경계와 척추는 인간의 것과 매우 유사하며, 뇌와 척수 구조 및 기능에서 유사성이 있습니다 ^1,5,6. 중요한 것은, 돼지의 척추와 척추관의 치수는 외과적 절차적 훈련(surgical procedural training^)9,10, 약물 침투(drug penetration)11,12,13, 척수 손상(spinal cord injury⁾¹⁴을 포함한 다양한 전^{임상 연구(7,8})에 적합하다는 것이다.

돼지 모델에서 CSF에 대한 액세스는 많은 실험 설정에서 매우 중요합니다. 요추 천자는 단일 CSF 샘플링 또는 척추내 약물 투여를 위한 방법을 제공하지만, 반복적인 요추 천자는 실용적이지 않습니다. 그들은 척추 내 혈종, 신경 손상 및 혈액에 의한 CSF 오염의 잠재적 위험을 제기합니다. 인간 환자의 경우, 척추 마이크로카테터는 동맥류성 지주막하 출혈 시 지속적인 요추 CSF 배액에 일반적으로 사용되며, 크기 유사성으로 인해 돼지의 연속 CSF 샘플링에도 동일하게 적합해야 합니다. 그러나 돼지의 종별 해부학적 차이로 인해 CSF 접근에 고유한 문제가 있습니다. 예를 들어, 겹치는 층판(laminae), 골화된 인대(ossified ligaments), 풍부한 경막외 지방 조직(epidous adipose tissue)의 존재로 인해 기존의 경피적 요추 천자 기법의 신뢰성이 떨어진다¹⁵. 괴팅겐 미니피그에서는 최소 침습적 경피적 방법이 사용되어 연속 CSF 샘플링이 가능합니다¹⁶. 이 방법은 요추 추간 공간의 수동 식별에 의존하며, 카테터 삽입 자체는 도입자의 시각화 없이 수행됩니다. 그러나 이 기법은 척추 크기, 가시돌기, 경막외 지방 조직의 양에 대한 해부학적 변화로 인해 경피외 카테터 삽입이 더 어렵기 때문에 몸집이 큰 돼지에게는 적합하지 않다¹⁵. 따라서 신뢰할 수 있는 카테터 배치를 보장하기 위해 더 큰 돼지 모델에서 척추 노출을 포함하는 보다 침습적인 방법이 필요할 수 있습니다.

이 원고의 목적은 L4/L5 수준에서 척추 카테터를 돼지 상쇄낭에 삽입하는 수술 절차를 설명하는 것입니다. 이 절차에는 피험자의 위치 지정, 해부학적 랜드마크를 기반으로 수술 절개 계획, 카테터 삽입 전에 척추의 뒤쪽 뼈 구조에 접근하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

피험자는 덴마크 동물실험검사국(면허 번호 2020-15-0201-00401)의 승인 하에 현지 규정에 따라 수용되었습니다. 주제 정보: 국내 돼지, 암컷, 약 40kg, 생후 3개월.

1. 피험자 주거 및 수술 전 금식

1. 적절한 적응을 보장하고 스트레스를 줄이기 위해 절차 전 최소 14일 동안 승인된 주거 펜에서 12시간 명/어두움 주기로 그룹별로 피험자를 수용¹⁷.
2. 피험자가 역류의 위험을 줄이기 위해 계획된 마취 전 12시간 동안 음식 금단 요법을 받았는지 확인하십시오. 피험자의 식단에 알팔파 또는 다른 종류의 건초가 포함되어 있는 경우, 위 배출 시간을 더 지연시킬 수 있으므로 시술 2-3일 전에 식단에서 제외해야 한다¹⁸.

2. 마취 및 모니터링

1. 케타민 6.25mg/mL, 졸라제팜 6.25mg/mL, 틸레타민 6.25mg/mL, 부토르판올 1.25mg/mL 및 자일라진 6.25mg/mL(Zoletil)의 혼합물을 2mL/10kg 체중의 근육 주사로 피험자를 마취합니다.
2. 체온 조절을 돕기 위해 피험자를 가열 담요 위에 누운 자세로 놓습니다.
3. 6.5 튜브¹⁹ 크기로 피험자를 삽관하고, 비가습 공기, 8-10 mL/kg의 일회 호흡량, 6.0 kPa의 호기말 CO₂ 농도에 따라 16-22 호흡/분의 호흡수로 기계적으로 환기시킨다<.
   알림: CO₂ 판독값은 튜브의 올바른 기관 내 위치를 확인합니다.
4. 3%-4% 기화된 세보플루란을 흡입하여 마취를 유지한다¹⁸.
5. 마취 중 건조를 피하기 위해 안과 연고를 양측으로 조심스럽게 바르십시오.
6. 10^분마다 근육 이완과 손바닥 움직임의 부재를 확인하여 충분한 마취 정도를 확인하십시오¹⁸.
7. 체온계가 있는 방광 카테터를 요도¹⁹ 를 통해 피험자의 방광에 삽입하여 체온을 모니터링하고 적절한 카테터 백에 소변을 수집합니다.
8. 경피적 천자에 의해 적절한 표재성 귀 정맥에 말초 정맥 카테터를 삽입하고 연속 식염수(NaCl, 0.9%) 주입, 약물 주입 및 연구 종료 시 안락사에 사용합니다.
9. 경피적 천자를 통해 오른쪽 대퇴동맥에 대퇴동맥 카테터(6 Fr 시트)를 삽입합니다. 지속적인 침습적 혈압 모니터링을 위해 이 액세스를 사용합니다.
10. 시술 내내 5분마다 피험자의 활력 징후를 모니터링합니다.
    참고: 활력 징후에는 맥박, 지속적인 침습성 동맥 혈압, 방광 내 온도 및 호기말 CO₂ 농도가 포함됩니다.

3. 동물 포지셔닝

1. 피험자를 수술대 중앙에 엎드린 자세로 놓습니다. 척추측만증을 피하기 위해 피험자의 척추가 곧게 펴지도록 하십시오.
2. 척추의 요추 부분 아래에 모래 주머니를 놓아 얇은 판 사이의 각도를 증가시킵니다.
3. 트리머로 수술 부위의 수염을 면도합니다.
4. 요오드 용액을 원심 패턴으로 수술 부위에 도포합니다. 수술 부위 전체가 덮일 때까지 이 과정을 반복합니다.
5. 피사체를 약간 기울여 똑바로 세웁니다.

4. 수술 장비의 준비

1. 재료표에 나열된 수술 장비를 준비합니다.

5. 주요 해부학적 랜드마크 식별

1. 피험자의 요추 양쪽에 있는 장골능을 확인하고 천골이 식별될 때까지 윤곽을 내측으로 따라갑니다(그림 1).
2. 천골의 두개골 측면과 L6의 가시돌기 사이의 정중선에서 추간 공간을 확인합니다.
3. L6, L5 및 L4의 가시돌기를 식별합니다(그림 1, 그림 2).

6. 가시돌기 노출시키기

1. 24번 메스를 사용하여 L4-L6의 가시돌기를 따라 정중선을 절개하여 피부와 피하 부위를 절개합니다.
2. 단극성을 사용하여 표재성 정맥과 세동맥에서 발생하는 작은 출혈을 소작합니다.
3. 외과 늪으로 피를 닦아내고 활동성 출혈을 확인하십시오. 그에 따라 모노폴라를 사용하십시오.
   참고: 혈종을 피하기 위해 경미한 출혈이라도 멈추는 것이 중요합니다.
4. 수술용 견인기를 삽입하고 개구부를 확장합니다.
5. 척추돌기에 대한 등쪽 상척추 인대를 확인합니다.
6. 약 1cm의 가시돌기가 보일 때까지 가시돌기의 측면을 따라 단극을 사용하여 절개 부위를 점차적으로 확장합니다(그림 3).
   참고: 시술을 하는 사람이 오른손잡이인 경우, 나중에 도입자의 삽입을 용이하게 하기 위해 가시돌기의 피험자의 오른쪽 측면 측면을 따르는 것을 고려해야 합니다.
7. L4/L5 사이의 척추간 인대를 확인합니다(그림 3).
8. 활성 출혈을 확인하고 그에 따라 소작을 위해 단극을 적용합니다.

7. 테칼 주머니에 대한 접근

1. 수동 촉진을 통해 가시돌기의 얇은 판 사이의 L4/L5 추간 공간을 확인합니다.
2. L4/L5 층내 공간을 향해 기울어진 두개골 방향으로 비스듬히 베벨과 내강이 있는 도입기를 배치합니다(그림 2, 그림 4, 그림 5).
3. 도입기가 30° 수평 및 45° 두개골 경사로 유지되는지 확인합니다(그림 5).
   알림: L4/L5 사이의 층내 공간을 조준합니다.
4. 부드러운 저항이 느껴질 때까지 점차적으로 도입자를 전진시킵니다. 이것은 flavum의 인대를 나타냅니다.
   참고: 무딘 저항의 감각은 도입자가 가시 돌기에 의해 멈췄다는 것을 나타냅니다. 이 경우 도입기를 1cm 후퇴시키고 약간 다른 경사로 다시 전진합니다.
5. 단단하면서도 매우 조심스럽게 압력을 가하고 갑작스런 저항 손실이 느껴질 때까지 플라범 인대를 통해 도입부를 밀리미터 단위로 전진시킵니다.
   주석: 피험자가 요추 근육 조직이나 뒷다리에서 운동 반사 신경을 보인다면, 이는 신경근에 직접 접촉했기 때문이지 마취가 불충분하기 때문이 아니다.
6. 눈에 보이는 CSF 흐름을 확인하기 위해 투관침을 제거하여 주입자의 각 진행을 따릅니다.
7. 주입자가 인대(ligamentum flavum)를 통과한 후 내폐물(CSF)의 흐름을 육안으로 확인하여 척추관 내 내도입자의 올바른 위치를 확인합니다.
   참고: CSF의 자발적 흐름은 느릴 수 있습니다. 주입자에 멸균 식염수를 채우고 맥동을 관찰하여 신속하게 확인할 수 있습니다.
8. 카테터를 준비하는 동안 CSF의 과도한 손실을 방지하기 위해 투관침을 주입기에 다시 삽입합니다.

8. 종골낭에 카테터 삽입

1. 가이드와이어를 카테터에 삽입합니다.
2. 도입기에서 투관침을 제거합니다.
3. 부드러운 저항이 느껴질 때까지 가이드와이어가 포함된 카테터를 도입기에 삽입합니다.
4. 도입부에서 원위 방향으로 5cm를 측정하고 수술 마커로 표시를 설정합니다.
5. 카테터가 종골낭 안으로 전진할 때 이전에 측정된 표시가 도입기에 도달할 때까지 부드럽지만 단단한 압력을 가합니다.
   주석: 골수 반사 작용으로 인해, 피험자는 충분히 마취되었음에도 불구하고 경련을 일으키거나 움직일 수 있다.
6. 카테터를 제자리에 유지하면서 주입기를 조심스럽게 집어넣습니다.
   알림: 유도체가 제거될 때 잘못된 위치를 방지하기 위해 피부 위에서 카테터가 보이는 즉시 카테터를 단단히 잡으십시오.
7. 피부 수준에서 카테터를 단단히 잡은 상태에서 가이드와이어를 제거합니다(그림 6).
8. 2mL 일회용 플라스틱 주사기를 카테터에 부착합니다.
9. 카테터에서 흡인 CSF로 척추관 내 위치를 확인합니다.
10. 주사기에 CSF가 없는 경우 카테터를 몇 밀리미터 부드럽게 집어넣어 개통성을 회복합니다.
11. 척추 카테터를 수술용 견인기에 고정하고 테이프로 피부를 고정하여 잘못된 배치를 방지합니다.

9. 지질다당류의 투여

1. 400μg의 대장균 지질다당류(LPS)(OH:143)를 중심 정맥판에 투여합니다.
2. 타이머를 시작합니다.

10. CSF 샘플링

1. 다음 24시간 동안 매시간 CSF 샘플을 채취하여 총 백혈구 수, CSF-알부민 및 CSF IgG를 측정합니다. 각 샘플에서 최대 0.5mL의 CSF를 추출합니다.

11. 안락사

1. 말초 정맥 카테터를 통해 펜토바르비탈(50mg/kg) 볼루스를 투여합니다.
2. 심장 마비를 확인하기 위해 호흡기에서 맥박, 혈압 및 호기말 CO₂ 농도 곡선을 평평하게 관찰합니다.

결과

돼지의 엎드린 자세는 요추에 대한 외과적 접근을 최적화합니다. 지지하는 모래주머니를 사용하면 인접한 요추돌기 사이의 각도가 증가하여 척추관에 대한 접근이 향상됩니다.

본 연구는 E. coli 지질다당류를 뇌실내 접종한 후 CSF 구획 내 염증 반응을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 총 10마리의 돼지가 이 시술을 받았고, 후속 CSF 분석에서 평?...

토론

돼지에서 지속적인 CSF 샘플링을 위한 요추 카테터 삽입에 대한 입증된 절차에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 성공적인 카테터 삽입을 위한 최적의 조건을 보장하기 위해 올바른 척추 수준이 노출되어야 합니다. 돼지 척수는 인간에 비해 꼬리 방향으로 더 뻗어 S2-S3 레벨¹⁵에 도달하며, 이는 L1-L2 레벨²⁰에서 끝나는 인간 원?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable operating table	N/A	N/A
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400mg/mL
Foley Catheter 12F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catheter with in-built thermosensor
Intravenous peripheral catheter	Avantor	BDAM381344	Size G18
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6F
Monopolar, ForceTriad System	Medtronic
Plastic Syringe, 2 mL	Becton, Dickinson and Company	300928
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthisa
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Silicone Lumbar Catheter incl. Introducer	Integra	NL8508330
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia