Tecnica chirurgica per l'inserimento di catetere spinale lombare nei suini che consente l'accesso continuo al sacco tecale in una configurazione terminale

Riepilogo

Presentiamo una tecnica per l'inserimento di un catetere spinale lombare a livello L4-L5 in un suino Landrace danese di 3 mesi come parte di un protocollo di ricerca terminale, che consente l'infusione continua o il campionamento del liquido cerebrospinale dal sacco tecale.

Abstract

I suini sono sempre più utilizzati come modello animale di grandi dimensioni per la ricerca farmacologica sul SNC a causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche tra il sistema nervoso centrale (SNC) suino e quello umano. Tuttavia, l'accesso al liquido cerebrospinale (CSF) nelle razze suine più grandi con le tecniche convenzionali di puntura lombare può essere difficile a causa di un orientamento obliquo dei processi spinosi spinali e di uno spazio interlaminare limitato. Di conseguenza, in questo lavoro viene descritta in modo approfondito una procedura chirurgica aperta per l'inserimento di un catetere spinale lombare lombare per il campionamento continuo del liquido cerebrospinale a livello L4/L5 nei suini. Dopo aver posizionato il maiale e identificato i punti di riferimento anatomici, viene praticata un'incisione chirurgica della linea mediana dorsale per esporre i processi spinosi. Facendo avanzare l'ago introduttore, il catetere spinale viene inserito all'interno del sacco tecale del canale spinale lasciando intatte le strutture ossee della colonna vertebrale. Questo metodo consente l'infusione continua o il campionamento dal sacco tecale suino con sanguinamento minimo o perdita di liquido cerebrospinale. La procedura è semplice, efficiente in termini di tempo e riproducibile in diverse configurazioni sperimentali, offrendo un potenziale significativo per vari studi preclinici, tra cui la ricerca farmacocinetica, la formazione chirurgica e i modelli di lesioni del midollo spinale.

Introduzione

I modelli animali sono essenziali quando limitazioni etiche o pratiche impediscono l'uso di soggetti umani per studiare malattie o testare metodi chirurgici. Sebbene i roditori siano comunemente usati a causa del loro basso costo, la loro rilevanza traslazionale è limitata da differenze significative rispetto agli esseri umani¹. I suini, tuttavia, offrono diversi vantaggi rispetto ai roditori, tra cui somiglianze anatomiche e fisiologiche con l'uomo, soprattutto nel contesto della ricerca sul SNC ^1,2. I modelli canini sono storicamente serviti come modelli sperimentali per la ricerca sul SNC, ma negli ultimi anni considerazioni etiche hanno limitato l'uso dei cani³. Inoltre, le dimensioni comparabili degli organi suini a quelle umane ne migliorano l'uso nella ricerca chirurgica e nella formazione procedurale⁴. Il SNC e la colonna vertebrale suina rispecchiano da vicino quelli degli esseri umani, con somiglianze nell'architettura e nella funzionalità del cervello e del midollo spinale ^1,5,6. È importante sottolineare che le dimensioni della colonna vertebrale e del canale spinale nei suini li rendono adatti a vari studi preclinici ^7,8, tra cui la formazione procedurale chirurgica ^9,10, la penetrazione di farmaci 11,12,13 e le lesioni del midollo spinale¹⁴.

L'accesso al CSF nei modelli suini è fondamentale in molte configurazioni sperimentali. Mentre la puntura lombare fornisce un metodo per il campionamento singolare del liquido cerebrospinale o la somministrazione intratecale di farmaci, le punture lombari ripetute non sono pratiche. Rappresentano un potenziale rischio di ematomi intraspinali, danni ai nervi e contaminazione del liquido cerebrospinale con il sangue. Nei pazienti umani, i microcateteri spinali sono comunemente usati per il drenaggio continuo del liquido cerebrospinale lombare nelle emorragie subaracnoidei aneurismatiche e dovrebbero, a causa delle somiglianze dimensionali, essere ugualmente adatti per il campionamento continuo del liquido cerebrospinale nei suini. Tuttavia, le differenze anatomiche specie-specifiche nei suini presentano sfide uniche per l'accesso al liquido cerebrospinale. Ad esempio, la presenza di lamine sovrapposte, legamenti ossificati e abbondante tessuto adiposo epidurale rende meno affidabili le tecniche convenzionali di puntura lombare percutanea¹⁵. Nei maialini di Gottinga è stato impiegato un metodo percutaneo minimamente invasivo, che consente il campionamento seriale del liquido cerebrospinale¹⁶. Questo metodo si basa sull'identificazione manuale degli spazi intervertebrali lombari e il cateterismo stesso viene eseguito senza la visualizzazione dell'introduttore. Tuttavia, questa tecnica è meno adatta per i suini più grandi, poiché le variazioni anatomiche delle dimensioni vertebrali, i processi spinosi e la quantità di tessuto adiposo epidurale rendono più difficile il cateterismo percutaneo¹⁵. Pertanto, nei modelli suini più grandi possono essere necessari metodi più invasivi che comportano l'esposizione della colonna vertebrale per garantire un posizionamento affidabile del catetere.

Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere la procedura chirurgica per l'inserimento di un catetere spinale nel sacco tecale suino a livello L4/L5. La procedura prevede il posizionamento del soggetto, la pianificazione dell'incisione chirurgica in base ai punti di riferimento anatomici e l'accesso alle strutture ossee posteriori della colonna vertebrale prima del cateterismo.

Protocollo

I soggetti sono stati alloggiati in conformità con le normative locali sotto l'approvazione dell'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali (licenza n. 2020-15-0201-00401). Informazioni sul soggetto: Suino domestico, femmina, circa 40 kg, 3 mesi di età.

1. Alloggio del soggetto e digiuno preoperatorio

1. Alloggiare i soggetti in gruppi a cicli luce/buio di 12 ore in recinti di stabulazione approvati per almeno 14 giorni prima della procedura per garantire una corretta acclimatazione e ridurre lo stress¹⁷.
2. Assicurarsi che i soggetti siano stati in regime di sospensione del cibo per 12 ore prima dell'anestesia programmata per ridurre il rischio di rigurgito. Se la dieta dei soggetti include erba medica o altri tipi di fieno, questo deve essere escluso dalla dieta 2-3 giorni prima della procedura, in quanto ciò può ritardare ulteriormente il tempo di svuotamento gastrico^.

2. Anestesia e monitoraggio

1. Anestetizzare il soggetto con un'iniezione intramuscolare di 2 ml/10 kg di peso corporeo di una miscela di ketamina 6,25 mg/mL, zolazepam 6,25 mg/mL, tiletamina 6,25 mg/mL, butorfanolo 1,25 mg/mL e xilazina 6,25 mg/mL (Zoletil).
2. Posizionare il soggetto in posizione supina sopra una coperta riscaldante per favorire la termoregolazione.
3. Intubare il soggetto con una provetta di dimensioni 6,5¹⁹ e ventilarla meccanicamente con aria non umidificata, un volume corrente di 8-10 mL/kg e una frequenza respiratoria di 16-22 respiri/min secondo le concentrazioni di CO₂ di fine espirazione espiratorie < 6,0 kPa.
   NOTA: Le letture di CO₂ confermano la corretta posizione intratracheale del tubo.
4. Mantenere l'anestesia per inalazione di sevoflurano¹⁸ vaporizzato al 3%-4%.
5. Applicare accuratamente gli unguenti oftalmici bilateralmente per evitare secchezza durante l'anestesia.
6. Garantire un grado sufficiente di anestesia controllando il rilassamento muscolare e l'assenza di movimento palpebrale ogni 10^{minuti 18}.
7. Inserire un catetere vescicale con un termometro nella vescica del soggetto attraverso l'uretra¹⁹ per monitorare la temperatura e raccogliere l'urina in una sacca per catetere adatta.
8. Inserire un catetere venoso periferico in una vena dell'orecchio superficiale adatta mediante puntura percutanea e utilizzarlo per l'infusione continua di soluzione salina (NaCl, 0,9%), l'infusione di farmaci e l'eutanasia alla fine dello studio.
9. Inserire un catetere dell'arteria femorale (foglio da 6 Fr) nell'arteria femorale destra attraverso una puntura percutanea. Utilizzare questo accesso per il monitoraggio continuo e invasivo della pressione sanguigna.
10. Monitorare i segni vitali del soggetto ogni 5 minuti durante la procedura.
    NOTA: I segni vitali includono polso, pressione arteriosa invasiva continua, temperatura intravescicale e concentrazione di CO₂ di fine espirazione.

3. Posizionamento degli animali

1. Posizionare il soggetto in posizione prona al centro del tavolo operatorio. Assicurarsi che la colonna vertebrale del soggetto sia dritta per evitare qualsiasi scoliosi.
2. Posiziona un sacco di sabbia sotto l'aspetto lombare della colonna vertebrale per aumentare l'angolazione tra le lamine.
3. Radere i peli dal sito chirurgico con un rifinitore.
4. Applicare la soluzione di iodio sul sito chirurgico in schemi centrifughi. Ripetere questo processo fino a coprire l'intero sito chirurgico.
5. Inclinare leggermente il soggetto in posizione verticale.

4. Preparazione delle attrezzature chirurgiche

1. Preparare l'attrezzatura chirurgica elencata nella Tabella dei Materiali.

5. Identificazione dei principali punti di riferimento anatomici

1. Identificare la cresta iliaca su ciascun lato della colonna lombare del soggetto e seguire i contorni medialmente fino a identificare l'osso sacro (Figura 1).
2. Identificare lo spazio intervertebrale nella linea mediana tra l'aspetto cranico dell'osso sacro e il processo spinoso di L6.
3. Identificare i processi spinosi di L6, L5 e L4 (Figura 1, Figura 2).

6. Esposizione dei processi spinosi

1. Praticare un'incisione sulla linea mediana lungo i processi spinosi L4-L6 utilizzando il bisturi n. 24, tagliando la pelle e il sottocute.
2. Utilizzare un monopolare per cauterizzare piccole emorragie dalle vene superficiali e dalle arteriole.
3. Asciugare il sangue con una palude chirurgica e verificare la presenza di sanguinamento attivo; Utilizzare il monopolare di conseguenza.
   NOTA: È importante fermare anche il sanguinamento minore per evitare ematomi.
4. Inserire il divaricatore chirurgico ed espandere l'apertura.
5. Identificare il legamento sovraspinoso dorsale ai processi spinosi.
6. Espandere gradualmente l'incisione con il monopolare lungo l'aspetto laterale dei processi spinosi fino a quando non è visibile circa 1 cm dei processi spinosi (Figura 3).
   NOTA: Se la persona che esegue la procedura è destrorsa, si dovrebbe considerare di seguire l'aspetto laterale destro del soggetto del processo spinoso per facilitare l'inserimento dell'introduttore in un secondo momento.
7. Identificare il legamento interspinale tra L4/L5 (Figura 3).
8. Verificare la presenza di sanguinamento attivo e applicare il monopolare per la cauterizzazione di conseguenza.

7. Accesso alla sacca tecaria

1. Identificare lo spazio intervertebrale L4/L5 tra la lamina dei processi spinosi mediante palpazione manuale.
2. Posizionare l'introduttore con il suo smusso e il lume orientati in direzione cranica inclinati verso lo spazio intralaminare L4/L5 (Figura 2, Figura 4, Figura 5).
3. Assicurarsi che l'introduttore sia mantenuto a un'inclinazione orizzontale di 30° e di 45° al cranio (Figura 5).
   NOTA: Puntare verso lo spazio intralaminare tra L4/L5.
4. Far avanzare gradualmente l'introduttore fino a quando non si avverte una leggera resistenza; Questo rappresenta il legamento flavum.
   NOTA: La sensazione di resistenza contundente indica che l'introduttore è fermato dal processo spinoso. In tal caso, ritrarre l'introduttore di 1 cm e avanzare nuovamente con un'inclinazione leggermente diversa.
5. Applicare una pressione decisa ma molto attenta e far avanzare l'introduttore millimetro per millilitro attraverso il legamento flavum fino a quando non si avverte un'improvvisa perdita di resistenza.
   NOTA: Se il soggetto presenta riflessi motori nella muscolatura lombare o nelle zampe posteriori, è dovuto al contatto diretto con le radici nervose e non ad un'anestesia insufficiente.
6. Seguire ogni avanzamento dell'introduttore rimuovendo il trocar per verificare il flusso visibile del liquido cerebrospinale.
7. Confermare il corretto posizionamento dell'introduttore all'interno del canale spinale mediante la conferma visiva del flusso di liquido cerebrospinale dall'introduttore dopo che è penetrato nel legamento flavum e, successivamente, nella dura madre.
   NOTA: Il flusso spontaneo di liquido cerebrospinale può essere lento. La conferma può essere accelerata riempiendo l'introduttore con soluzione fisiologica sterile e osservando la pulsazione.
8. Reinserire il trocar nell'introduttore per evitare un'eccessiva perdita di liquido cerebrospinale durante la preparazione del catetere.

8. Inserimento del catetere nella sacca tecale

1. Inserire il filo guida nel catetere.
2. Rimuovere il trocar dall'introduttore.
3. Inserire il catetere, contenente il filo guida, nell'introduttore fino a quando non si avverte una leggera resistenza.
4. Misurare a 5 cm distalmente dall'introduttore e segnare con il pennarello chirurgico.
5. Applicare una pressione delicata ma decisa mentre il catetere viene fatto avanzare nel sacco tecale fino a quando il segno precedentemente misurato raggiunge l'introduttore.
   NOTA: A causa dei riflessi midollari, il soggetto potrebbe contrarsi/muoversi nonostante sia sufficientemente anestetizzato.
6. Ritrarre con cautela l'introduttore mantenendo il catetere in posizione.
   NOTA: Applicare una presa salda sul catetere non appena è visibile sopra la pelle per evitare un posizionamento errato durante la rimozione dell'introduttore.
7. Rimuovere il filo guida mantenendo una presa salda sul catetere a livello della pelle (Figura 6).
8. Collegare una siringa di plastica monouso da 2 ml al catetere.
9. Confermare la posizione all'interno del canale spinale aspirando il liquido cerebrospinale dal catetere.
10. In caso di mancanza di liquido cerebrospinale nella siringa, ritrarre delicatamente il catetere di alcuni millimetri per ripristinare la pervietà.
11. Fissare il catetere spinale al divaricatore chirurgico e alla pelle con del nastro adesivo per evitare un posizionamento errato.

9. Somministrazione di lipopolisaccaride

1. Somministrare 400 μg di lipopolisaccaride (LPS) di E. coli (OH:143) nel foglio venoso centrale.
2. Avvia un timer.

10. Campionamento del liquido cerebrospinale

1. Ottenere campioni di liquido cerebrospinale ogni ora per le successive 24 ore per misurare la conta totale dei leucociti, l'albumina nel liquido cerebrospinale e le IgG nel liquido cerebrospinale. Prelevare un massimo di 0,5 mL di liquido cerebrospinale in ciascun campione.

11. Eutanasia

1. Somministrare un bolo di pentobarbital (50 mg/kg) attraverso il catetere venoso periferico.
2. Osservare il polso, la pressione sanguigna e le curve di concentrazione di CO₂ di fine espirazione sul respiratore per la linea piatta come conferma dell'arresto cardiaco.

Risultati

La posizione prona del maiale ottimizza l'accesso chirurgico alle vertebre lombari. L'uso di sacchi di sabbia di supporto aumenta l'angolazione tra i processi spinosi lombari adiacenti, migliorando così l'accesso al canale spinale.

Il presente studio mirava a indagare la risposta infiammatoria all'interno del compartimento liquorale dopo l'inoculazione intraventricolare con lipopolisaccaride di E. coli . Un totale di 10 suini sono stati sottoposti al...

Discussione

La procedura dimostrata per l'inserimento del catetere lombare per il campionamento continuo del liquido cerebrospinale nei suini prevede diversi passaggi cruciali. In primo luogo, è necessario esporre il livello vertebrale corretto per garantire le condizioni ottimali per il successo del cateterismo. Il midollo spinale suino si estende ulteriormente caudalmente rispetto all'uomo, raggiungendo il livello S2-S3¹⁵, in contrasto con il cono midollare umano, che term...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable operating table	N/A	N/A
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400mg/mL
Foley Catheter 12F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catheter with in-built thermosensor
Intravenous peripheral catheter	Avantor	BDAM381344	Size G18
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6F
Monopolar, ForceTriad System	Medtronic
Plastic Syringe, 2 mL	Becton, Dickinson and Company	300928
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthisa
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Silicone Lumbar Catheter incl. Introducer	Integra	NL8508330
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia