Хирургическая техника введения поясничного спинномозгового катетера у свиней, обеспечивающая непрерывный доступ к текальному мешку в терминальной установке

Резюме

Мы представляем методику введения поясничного спинномозгового катетера на уровне L4-L5 у 3-месячной свиньи датской породы Ландрас в рамках протокола терминального исследования, что позволяет проводить непрерывную инфузию или забор образцов спинномозговой жидкости из текального мешка.

Аннотация

Свиньи все чаще используются в качестве крупной животной модели для фармакологических исследований ЦНС из-за анатомического и физиологического сходства между центральной нервной системой (ЦНС) свиньи и человека. Тем не менее, доступ к спинномозговой жидкости (СМЖ) у крупных пород свиней с помощью обычных методов люмбальной пункции может быть затруднен из-за косой ориентации спинномозговых остистых отростков и ограниченного межслойного пространства. Соответственно, в данной работе подробно описана открытая хирургическая процедура введения поясничного спинального катетера для непрерывного забора СМЖ на уровне L4/L5 у свиней. После позиционирования свиньи и определения анатомических ориентиров делается дорсальный хирургический разрез по средней линии, чтобы обнажить остистые отростки. Продвигая иглу проводника, спинномозговой катетер вводится внутрь текального мешка позвоночного канала, оставляя костные структуры позвоночника нетронутыми. Этот метод обеспечивает непрерывную инфузию или отбор проб из текального мешка свиньи с минимальным кровотечением или утечкой ликвора. Процедура проста, эффективна по времени и воспроизводима в различных экспериментальных установках, предлагая значительный потенциал для различных доклинических исследований, включая фармакокинетические исследования, хирургическое обучение и модели травм спинного мозга.

Введение

Животные модели необходимы, когда этические или практические ограничения не позволяют использовать людей для исследования заболеваний или тестирования хирургических методов. В то время как грызуны широко используются из-за их низкой стоимости, их трансляционная значимость ограничена значительными отличиями от человека¹. Свиньи, однако, имеют ряд преимуществ по сравнению с грызунами, включая анатомическое и физиологическое сходство с человеком, особенно в ^{контексте исследований} ЦНС. Собачьи модели исторически служили экспериментальными моделями для исследований ЦНС, но этические соображения ограничивали использование собак в^{последние годы.} Кроме того, сопоставимые размеры органов свиньи с человеческими увеличивают их использование в хирургических исследованиях и процедурном обучении⁴. ЦНС и позвоночник свиньи очень похожи на человеческие, с сходством в архитектуре и функциональности головного и спинного мозга ^1,5,6. Важно отметить, что размеры позвоночного столба и спинномозгового канала у свиней делают их пригодными для проведения различных доклинических исследований ^7,8, включая хирургическую процедурную подготовку ^9,10, проникновение лекарственных препаратов 11,12,13 и травмы спинного мозга¹⁴.

Доступ к спинномозговой жидкости в моделях свиней имеет решающее значение во многих экспериментальных установках. В то время как люмбальная пункция обеспечивает метод однократного отбора образцов спинномозговой жидкости или интратекального введения лекарств, повторные люмбальные пункции непрактичны. Они представляют потенциальный риск внутриспинальных гематом, повреждения нервов и загрязнения ликвора кровью. У пациентов микрокатетеры позвоночника обычно используются для непрерывного дренирования поясничной спинномозговой жидкости при аневризматических субарахноидальных кровоизлияниях и, из-за сходства размеров, должны быть одинаково пригодны для непрерывного отбора проб спинномозговой жидкости у свиней. Тем не менее, видоспецифичные анатомические различия у свиней создают уникальные проблемы для доступа к спинномозговой жидкости. Например, наличие перекрывающихся пластинок, окостенелых связок и обильного эпидурального жирового тканя делает традиционные методы чрескожной люмбальной пункции^{менее надежными}. У гёттингенских минипигов был использован минимально инвазивный чрескожный метод, который позволяет осуществлять серийный отбор проб спинномозговой жидкости¹⁶. Этот метод основан на ручной идентификации поясничных межпозвоночных пространств, а сама катетеризация выполняется без визуализации проводника. Однако этот метод менее подходит для более крупных свиней, так как анатомические вариации размера позвонков, остистых отростков и количества эпидуральной жировой ткани затрудняют чрескожную катетеризацию^. Таким образом, в более крупных моделях свиней могут потребоваться более инвазивные методы, включающие обнажение позвоночника, чтобы обеспечить надежную установку катетера.

Целью данной рукописи является описание хирургической процедуры введения спинномозгового катетера в текальный мешок свиньи на уровне L4/L5. Процедура включает в себя позиционирование субъекта, планирование хирургического разреза на основе анатомических ориентиров и доступ к задним костным структурам позвоночника перед катетеризацией.

протокол

Субъекты были размещены в соответствии с местными нормами с разрешения Датской инспекции по экспериментам на животных (лицензия No 2020-15-0201-00401). Информация о предмете: Домашняя свинья, самка, весом около 40 кг, возраст 3 месяца.

1. Предмет размещения и предоперационного голодания

1. Размещение субъектов в группах по 12 часов светлых/темных циклов в утвержденных загонах для содержания в течение не менее 14 дней до процедуры для обеспечения надлежащей акклиматизации и снижения стресса¹⁷.
2. Убедитесь, что субъекты находились на режиме отмены пищи в течение 12 часов до запланированной анестезии, чтобы снизить риск срыгивания. Если рацион испытуемых включает люцерну или другие виды сена, это должно быть исключено из рациона за 2-3 дня до процедуры, так как это может задержать время опорожнения желудка еще^{на 18} дней.

2. Анестезия и мониторинг

1. Обезболивайте пациента с помощью внутримышечной инъекции 2 мл/10 кг массы тела смеси кетамина 6,25 мг/мл, золазепама 6,25 мг/мл, тилетамина 6,25 мг/мл, буторфанола 1,25 мг/мл и ксилазина 6,25 мг/мл (Золетил).
2. Поместите объект в лежачем положении на спине поверх одеяла с подогревом для поддержания терморегуляции.
3. Интубируйте пациента с помощью трубки¹⁹ размера 6,5 и проветрите его механическим способом с помощью неувлажненного воздуха, дыхательный объем 8-10 мл/кг и частота дыхания 16-22 вдоха/мин в соответствии с концентрацией_СО2 в конце выдоха < 6,0 кПа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Показания CO₂ подтверждают правильное внутритрахеальное расположение трубки.
4. Поддерживайте анестезию путем ингаляции 3%-4% испаренного севофлурана¹⁸.
5. Наносите офтальмологические мази осторожно с обеих сторон, чтобы избежать сухости во время анестезии.
6. Обеспечьте достаточную степень анестезии, проверяя расслабление мышц и отсутствие движения глаз каждые^10-ю минуту¹⁸.
7. Введите катетер мочевого пузыря с термометром в мочевой пузырь субъекта через мочеиспускательный канал¹⁹ для контроля температуры и сбора мочи в подходящий мешок для катетера.
8. Введите периферический венозный катетер в подходящую поверхностную вену уха путем чрескожной пункции и используйте его для непрерывной инфузии физиологического раствора (NaCl, 0,9%), инфузии лекарств и эвтаназии в конце исследования.
9. Вставьте катетер бедренной артерии (лист 6 Fr) в правую бедренную артерию через чрескожный прокол. Используйте этот доступ для непрерывного инвазивного мониторинга артериального давления.
10. Контролируйте жизненные показатели субъекта каждые 5 минут на протяжении всей процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизненно важные показатели включают пульс, непрерывное инвазивное артериальное давление, внутрипузырную температуру и концентрацию_CO2 в конце выдоха.

3. Позиционирование животного

1. Поместите пациента в положение лежа по центру операционного стола. Убедитесь, что позвоночник объекта прямой, чтобы избежать сколиоза.
2. Поместите мешок с песком под поясничную часть позвоночника, чтобы увеличить угол между пластинками.
3. Сбрейте волосы в месте операции с помощью триммера.
4. Нанесите раствор йода на операционное поле центробежными схемами. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет покрыто все операционное место.
5. Слегка наклоните объект в вертикальное положение.

4. Подготовка хирургического оборудования

1. Подготовьте хирургическое оборудование, указанное в Таблице материалов.

5. Определение ключевых анатомических ориентиров

1. Определите подвздошный гребень с каждой стороны поясничного отдела позвоночника пациента и следуйте контурам медиально до тех пор, пока не будет определен крестец (Рисунок 1).
2. Определите межпозвоночное пространство по средней линии между краниальной стороной крестца и остистым отростком L6.
3. Определите остистые отростки L6, L5 и L4 (рис. 1, рис. 2).

6. Обнажение остистых отростков

1. Сделайте разрез по средней линии вдоль остистых отростков L4-L6 с помощью скальпеля No 24, разрезая кожу и подкожную клетчатку.
2. Используйте монополяр для прижигания небольших кровотечений из поверхностных вен и артериол.
3. Вытрите кровь хирургическим болотом и проверьте наличие активного кровотечения; Используйте монополярность соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно остановить даже незначительные кровотечения, чтобы избежать гематом.
4. Вставьте хирургический ретрактор и расширьте отверстие.
5. Определите надостную связку дорсально по отношению к остистым отросткам.
6. Постепенно расширяйте разрез монополярным вдоль латеральной поверхности остистых отростков до тех пор, пока не станет виден примерно 1 см остистых отростков (рис. 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если человек, выполняющий процедуру, является правшой, следует рассмотреть возможность наблюдения за правой боковой стороной остистого отростка субъекта, чтобы облегчить введение интродьюсера позже.
7. Определите межостистую связку между L4/L5 (Рисунок 3).
8. Проверьте наличие активного кровотечения и приложите монополяр для прижигания соответственно.

7. Доступ к текальному мешку

1. Определите межпозвонковое пространство L4/L5 между пластинками остистых отростков путем ручной пальпации.
2. Поместите интродьюсер так, чтобы его скос и просвет были ориентированы в краниальном направлении под углом к интраламинарному пространству L4/L5 (рис. 2, рис. 4, рис. 5).
3. Убедитесь, что интродьюсер находится под углом 30° по горизонтали и 45° наклона черепа (Рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к интраламинарному пространству между L4/L5.
4. Постепенно продвигайте интродьюсер до тех пор, пока не почувствуете легкое сопротивление; Это представляет собой желтую связку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ощущение тупого сопротивления указывает на то, что интродьюсер остановлен остистым отростком. Если это произошло, втяните интродьюсер на 1 см и снова продвигайтесь под несколько другим наклоном.
5. Надавите сильно, но очень осторожно и продвигайте интродьюсер миллиметр за миллилитром через желтовато-литровую связку до тех пор, пока не почувствуете внезапную потерю сопротивления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если у субъекта проявляются двигательные рефлексы в поясничной мускулатуре или задних конечностях, это происходит из-за прямого контакта с нервными корешками, а не из-за недостаточной анестезии.
6. Следите за каждым продвижением интродьюсера, снимая троакар, чтобы проверить видимый поток спинномозговой жидкости.
7. Подтвердите правильность размещения интродьюсера в спинномозговом канале путем визуального подтверждения потока ликвора из интродьюсера после того, как он проник в желтую связку и, впоследствии, в твердую мозговую оболочку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спонтанное течение спинномозговой жидкости может быть медленным. Подтверждение можно ускорить, заполнив интродьюсер стерильным физиологическим раствором и наблюдая за пульсацией.
8. Снова вставьте троакар в проводник, чтобы избежать чрезмерной потери спинномозговой жидкости при подготовке катетера.

8. Введение катетера в текальный мешок

1. Вставьте проводник в катетер.
2. Снимите троакар с интродьюсера.
3. Вставьте катетер, содержащий проводник, в проводник до тех пор, пока не почувствуется легкое сопротивление.
4. Отмерьте расстояние в 5 см от проводника и установите отметку хирургическим маркером.
5. Мягко, но сильно надавливайте по мере того, как катетер продвигается в текальный мешок, пока ранее измеренная отметка не достигнет проводника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за медуллярных рефлексов субъект может дергаться/двигаться, несмотря на достаточную анестезию.
6. Осторожно втяните проводник, удерживая катетер на месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крепко захватите катетер, как только он станет виден над кожей, чтобы избежать смещения при удалении проводника.
7. Снимите проводник, крепко удерживая катетер на уровне кожи (рисунок 6).
8. Прикрепите к катетеру одноразовый пластиковый шприц объемом 2 мл.
9. Подтвердите расположение в спинномозговом канале с помощью аспирации спинномозговой жидкости из катетера.
10. В случае отсутствия ликвора в шприце аккуратно втяните катетер на несколько миллиметров для восстановления проходимости.
11. Закрепите спинальный катетер на хирургическом ретракторе и коже с помощью ленты, чтобы избежать смещения.

9. Введение липополисахарида

1. Введите 400 мкг липополисахарида (ЛПС) E . coli (OH:143) в центральный венозный слой.
2. Запустите таймер.

10. Отбор проб спинномозговой жидкости

1. Получайте образцы спинномозговой жидкости ежечасно в течение следующих 24 часов для измерения общего количества лейкоцитов, ликвора-альбумина и IgG ликвора. Наберите максимум 0,5 мл спинномозговой жидкости в каждом образце.

11. Эвтаназия

1. Введение болюса пентобарбитала (50 мг/кг) через периферический венозный катетер.
2. Наблюдайте за пульсом, артериальным давлением и кривыми концентрации_CO2 в конце выдоха на респираторе в качестве подтверждения остановки сердца.

Результаты

Положение свиньи в положении лежа на животе оптимизирует хирургический доступ к поясничным позвонкам. Использование поддерживающих мешков с песком увеличивает угол между соседними поясничными остистыми отростками, тем самым улучшая доступ к позвоночному каналу.

...

Обсуждение

Продемонстрированная процедура введения поясничного катетера для непрерывного отбора проб спинномозговой жидкости у свиней включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, необходимо обнажить правильный уровень позвонков, чтобы обеспечить оптимальные условия ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable operating table	N/A	N/A
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400mg/mL
Foley Catheter 12F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catheter with in-built thermosensor
Intravenous peripheral catheter	Avantor	BDAM381344	Size G18
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6F
Monopolar, ForceTriad System	Medtronic
Plastic Syringe, 2 mL	Becton, Dickinson and Company	300928
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthisa
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Silicone Lumbar Catheter incl. Introducer	Integra	NL8508330
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia