使用定制的 3D 打印模具生产和分析巴 氏 孢子丝菌生物水泥砖，用于无侧限压缩试验

摘要

巴氏孢子丝菌 是一种尿道溶解细菌，可将尿素分解成碳酸盐和铵。碳酸盐与钙结合形成碳酸钙，形成晶格，将周围的颗粒锚定在一起以生产生物水泥。这是使用 3D 打印模具制造适合压缩测试的生物水泥砖的便捷协议。

摘要

水泥是全球许多结构中使用的关键建筑材料，从房屋地基到历史古迹和道路。它是世界范围内重要且丰富的材料。然而，传统的水泥生产是人为大气中二氧化碳的主要_{贡献者，导致}温室气体排放和气候变化。微生物诱导方解石沉淀 （MICP） 是一种生物过程，其中 巴氏 孢子丝菌或其他细菌产生与传统水泥一样坚固的水泥材料，但生物水泥是碳中和的。这种生产生物水泥的 MICP 方法是一项很有前途的技术，目前许多公司、国家和研究小组都在积极研究中。此处介绍的协议采用定制设计的、可重复使用的 3D 打印模具对土壤或沙子进行流通式 MICP 处理，生产出符合无侧限压缩测试标准规格的圆柱形砖块。单独的、独立的、带储液罐的模具可以方便地对多个变量和重复进行平行测试。该协议概述了 巴氏葡萄球菌 MICP 反应以及 3D 打印模具的创建、组装和使用 3D 打印模具来生成生物水泥圆柱形砖。

引言

混凝土是世界各地建筑项目的主要建筑材料 ^1,2。一项研究发现，水泥是世界上消耗量第二大的材料，仅次于水³。每年生产近 41 亿吨水泥 ^4,5.传统的水泥生产、加工和应用每年导致全球近 8% 的_CO2 排放量⁶。由于传统水泥生产的高需求和破坏性影响，一种新颖的碳中和粘接方法是全球可持续发展目标的重中之重 7,8,9,10。

生物胶结是利用微生物生产水泥、粘合剂或可用于形成固体表面或结构的物质的过程 ^1,11。最明确的生物胶结过程涉及使用尿酸分解细菌沉淀碳酸钙，将颗粒连接在一起形成硬化的水泥材料^12,13。

在考虑传统水泥的环保替代品时，该替代品还必须满足水泥的强度预期。无侧限压缩试验是一种分析测量方法，用于确定岩石、建筑材料或土壤样品的剪切强度¹⁴。为了进行有效的剪切测试，必须根据行业标准制备样品，其中包括 1：2 的直径高度比和¹⁵ 圆柱形。为了满足这些标准并提高执行 MICP 方案的效率，我们创建了一个定制设计的 3D 打印模具。这些定制设计的模具允许连续 MICP 处理的流通应用和引流。细菌培养和胶合溶液可以很容易地涂在顶部储液器上，然后流经模具，穿过模具底部的网状开口。模具设计为放在烧杯或其他废物收集容器的顶部。模具垂直分为两半，以便于胶合砖脱模。它由固定在模具框架上的八个磁铁固定在一起，并用环氧树脂密封，以防止磁铁因暴露于 MICP 溶液而损坏。两半还包含一个嵌入式凹槽，用于放置橡胶垫圈，这有助于密封模具并防止泄漏。圆柱形模具的内侧有一个凹槽，用于指示沙子/土壤的填充水平，以生产 3 英寸高的砖块;该凹槽上方的空间旨在用作应用处理溶液的蓄水池。构造时，放置在模具内部底部开口上的一块金属丝网可防止沙子或土壤从模具底部掉落。此外，在沙子或土壤的顶部放置一块金属丝网，以帮助均匀分布施加的溶液，并确保形成的砖块顶部平坦，没有任何尖锐的脊线，这可能会影响无侧限的压缩测试结果。

模具使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计，并从 CAD 文件（补充文件 3 和补充文件 4）生成 STL 文件（补充文件 1 和补充文件 2）。此 STL 文件被上传到 3D 打印机程序中，随后进行打印。打印模具后，使用水射流系统去除 3D 打印机生成的支撑材料，留下最终的 3D 打印结构。还包括用于打印夯实装置以帮助压实模具中的沙子/土壤并创建水平顶面的文件。

研究方案

材料 表中列出了所用试剂、设备和软件的详细信息。

1. 溶液和培养基的制备

1. 脑心输液 （BHI） - 尿素培养基 （1 L）
   1. 使用天平称取 37 g BHI 粉末，并加入 1 L 烧瓶或烧杯中。
   2. 使用天平称取 20 g 尿素，并加入相同的 1 L 烧瓶或装有 BHI 粉末的烧瓶或烧杯中。
      注意：请勿对任何含有尿素的材料进行高压灭菌或添加漂白剂。尿素会分解成氨，氨作为挥发气体可能有害，并且会与漂白剂反应形成有毒的芥子气。根据机构的安全规程，将所有废物作为危险废物处理。
   3. 在装有 BHI 粉末和尿素的 1 L 烧瓶或烧杯中加入 1 L H₂O。
   4. 用 0.45 μM 过滤器混合并过滤，将培养基灭菌到高压灭菌的烧瓶或烧杯中。
2. 胶合溶液 （1 L）
   1. 使用天平称取 20 g 尿素，并加入 1 L 烧瓶或烧杯中。
   2. 使用天平称取 10 g NH₄Cl（氯化铵），并加入同一个含有尿素的 1 L 烧瓶或烧杯中。
      注意：请勿对任何含有氯化铵的材料进行高压灭菌或添加漂白剂。氯化铵会与氨气形成平衡，氨气作为挥发气体可能有害，并且会与漂白剂反应生成有毒的芥子气。根据您所在机构的安全规程，将所有废物作为危险废物处理。
   3. 使用天平称取 49 g CaCl 4.2H₂O（氯化钙），并加入相同的 1 L 烧瓶或装有尿素和氯化铵的烧杯中。
   4. 在装有尿素、氯化铵和氯化钙的 1 L 烧瓶或烧杯中加入 1 L H₂O。
      注：此溶液未灭菌;新鲜准备并在 48 小时内使用。
3. 砖印和准备（在 MICP 处理前几天进行）
   1. 将砖模的 STL 文件（补充文件 1）和夯实装置（补充文件 2）加载到 3D 打印机的相应程序中。
      注意：使用不同的 3D 打印机时，使用的特定程序可能会有所不同。使用适用于您正在使用的打印机的程序。
   2. 打印模具和夯实装置（图 1）。
   3. 根据打印机要求加工模具。
   4. 在模具中的每个适当磁铁槽中放置一个磁铁，确保电荷的位置使模具的两半相互吸引并且不会相互排斥
   5. 适当放置磁铁后，用环氧树脂密封每个磁铁。
   6. 选择两个直径为 1.5 英寸的金属丝网圆圈并放在一边。

2. 积木准备（第 0 天）

注意： 此处提供了准备一块砖的详细信息。

1. 过滤对 150 mL BHI-尿素培养基进行灭菌。高压灭菌 250 mL 培养瓶。
2. 准备 250 mL 胶合溶液;请勿将其放入高压灭菌的 250 mL 培养瓶中。
3. 在装有 BHI 尿素琼脂的培养皿上准备 巴氏血吸 虫分离的条纹培养物，并在 30°C 下孵育 24-48 小时（来自冷冻甘油原液的巴氏血吸 虫）。
4. 巴氏链球菌的发酵剂培养（第 1 天）
   1. 向培养管中加入 1.6 mL BHI-尿素培养基，制备 1.6 mL 起始培养物。
   2. 用第 0 天条纹板中的 1 个菌落接种培养物。
   3. 将发酵剂培养物在摇床 （150 rpm） 中于 30 °C 培养过夜。
5. 培养生长（第 2 天）
   1. 检查发酵剂培养物以确认生长（明显表现为浊度增加）。
   2. 向 250 mL 高压灭菌瓶中加入 40 mL BHI-尿素培养基。将 1.6 mL 发酵剂培养物倒入培养瓶中。在 30 °C 下孵育并摇动 7 小时。
   3. 向培养瓶中再添加 40 mL BHI-尿素培养基。将烧瓶置于 20°C 的摇床中过夜（~16 小时）。
6. 用 巴氏葡萄球菌 进行砖块处理（第 3 天）
   1. 向过夜培养瓶中加入另外 40 mL BHI-尿素培养基，并继续在 20°C 下孵育 巴氏链球菌 。
7. 准备砖模（第 3 天）（见 图 2）。
   1. 将橡胶垫圈放在模具上的适当空间。连接模具的两半，确保垫圈密封且所有磁铁都已连接。
   2. 在圆柱形砖模底部加一圈细丝网，以防止沙子从模具上的孔中落下。
   3. 用沙子或其他材料填充模具，直到模具内部的线，然后牢固地夯实。
   4. 在沙子的顶部放置另一圈金属丝网，以覆盖整个顶面并再次夯实。
   5. 将模具放在废液容器的顶部，以收集流过的液体。
8. 治疗程序（第 3 天）
   1. 将 40 mL 巴氏葡萄球菌 培养物倒在沙子上，让它浸泡。等待 45 分钟。
   2. 将 80 mL 的胶合溶液倒在沙子上。等待 30 分钟。
   3. 将 40 mL 巴氏葡萄球菌 培养物倒在沙子上。等待 30 分钟。
   4. 将 80 mL 的胶合溶液倒在沙子上。等待 30 分钟。
   5. 将 40 mL 巴氏葡萄球菌 培养物倒在沙子上。等待 30 分钟。
   6. 将 80 mL 的胶合溶液倒在沙子上。将砖块单独放置至少 48 小时或直到沙子看起来干燥。
9. 检查最终产品（第 5 天）。
   1. 将模具一分为二并释放磁铁的压力，小心地打开模具。轻轻地从模具中取出砖块。
      注意：如果沙子看起来很湿，模具需要再干燥一两天，然后才能从模具中取出砖块（砖块越干燥，越容易去除）。
   2. 将砖块放在纸巾上继续干燥 3 周，然后再进行压缩测试。
10. 清洁模具（第 5 天）
    1. 从模具中取出砖块后，将垫圈和金属丝网与模具的每一半分开。
    2. 将金属丝网浸泡在 70% 乙醇溶液中 24 小时，然后用水冲洗。可能需要轻微擦洗才能清洁网片。
    3. 用 70% 乙醇冲洗模具，并用软毛刷、海绵或其他清洁设备擦洗至少 3 次;然后用肥皂和水清洁，然后风干
    4. 用 70% 乙醇冲洗垫圈，然后用肥皂和水清洁，然后风干。

3. 压缩测试（第 25 天）

1. 使用无侧限压缩试验分析所有砖块的强度¹⁶.
   1. 确保砖的圆形末端平坦均匀。如果末端不平整，请使用锉刀或其他设备平整表面。
      注意： 如果金属丝网应用正确，砖的末端应该大部分是平坦的。砖的末端尽可能均匀以确保准确测量强度至关重要。
2. 将砖块放入带拉链或密封的塑料袋中，然后将砖块放入塑料袋中，使砖块的平面不被接缝覆盖，从而实现平滑、平坦的覆盖。
3. 将砖块放在下部装载板上。在砖块顶部放置一个平坦且均匀的装载板。
4. 通过无侧限压缩试验机对砖施加约 1 磅的压力。
5. 去皮数字读数。
6. 根据机器规格连续施加增加的负载，直到砖的结构完全失效。
7. 记录每块砖的最大承重载荷。执行所需的统计分析以评估结果。

结果

3D 打印模具的结构如图 1 和图 2 所示。积极的结果应该被视为砖块在从模具中取出时保持其形状，并且在干燥 3 周后，看起来是一个坚固的结构，可以很容易地处理，并且触摸造成的材料损失最小。如果砖块不坚固，并且因触摸或移动而碎裂或造成重大材料损失，则可能是培养基或培养物制备中存在错误。正负砖结果的示例如...

讨论

关键步骤
该生物胶结协议利用巴氏链球菌 MICP 生产适用于无限制压缩测试的生物胶结圆柱形砖。无侧限压缩测试的最关键因素之一是样品的形状和结构。确保圆筒产品的顶部和底部平坦，砖的高度尽可能接近 3 英寸;略高于 3 英寸的高度标记比低于 3 英寸要好。由于沙子/土壤的沉降，在进行处理时会损失一点高度;因此，建议在初始处理之前稍微填充...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-Printer	Stratasys	Objet 30 V3	Objet30 Pro V3.0 Desktop 3D-Printer
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04066	Rigur RGD450 Model Material
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04020	Sup 705 Support Material
Ammonium Chloride	Fisher Scientific	A661-500	Any other Ammonium Chloride should work, manufacturer should not matter
Brain Heart Infusion Broth	Millipore	53286	Any other Brain Heart Infusion Broth should work, manufacturer should not matter
Calcium Chloride Dihydrate	VWR	BDH9224	Any other Calcium chloride Dihydrate should work, manufacturer should not matter
Coarse Sand	Ward’s	470016-902	Special Sand-Gravel Mix and Stress Clay
Desktop Water Jet	Stratasys	OBJ-01400	Water jet system for post-processing of 3D prints
Epoxy	Gorilla Glue	4200102	GORILLA Epoxy Adhesive: Epoxy, 0.8 fl oz, Syringe, Clear, Thick Liquid
Fine Sand	Sandtastik	PLA25	Play Sand in Sparkling White
Gasket Material	McMaster-Carr	8525T65	Ethylene-propylene diene monomer (EPDM) 1/16” thickness
GrabCAD	Stratasys	GrabCAD	3D printer software
Magnets	K&J Magnetics	D64-N52	Neodymium Magnet Grade N52
SolidWorks 2021	Dassault Systèmes	SolidWorks 2021	CAD software
Sporosarcina pasteurii			Strain: ATCC 11859 / DSM 33
Vacuum Filtration cup 0.45µm	VWR	10040-450
Wire Mesh 1.5” Diameter Discs	McMaster-Carr	2812T43	Steel Wire Mesh Material