Produzione e analisi di mattoni in biocemento Sporosarcina pasteurii utilizzando stampi personalizzati stampati in 3D per prove di compressione non confinate

Riepilogo

La Sporosarcina pasteurii è un batterio ureolitico che scompone l'urea in carbonato e ammonio. Il carbonato si combina con il calcio per formare carbonato di calcio, creando un reticolo cristallino che ancora le particelle circostanti per produrre biocemento. Questo è un protocollo conveniente per l'utilizzo di stampi stampati in 3D per creare mattoni di biocemento adatti ai test di compressione.

Abstract

Il cemento è un materiale da costruzione chiave utilizzato in molte strutture in tutto il mondo, dalle fondamenta delle case ai monumenti storici e alle strade. È un materiale critico e abbondante in tutto il mondo. Tuttavia, la produzione tradizionale di cemento è uno dei principali fattori che contribuiscono alla CO₂ atmosferica prodotta dall'uomo, con conseguenti emissioni di gas serra e cambiamenti climatici. La precipitazione microbica della calcite (MICP) è un processo biologico in cui la Sporosarcina pasteurii o altri batteri producono un materiale cementizio resistente quanto il cemento tradizionale, ma il biocemento è a emissioni zero. Questo metodo MICP per la produzione di biocemento è una tecnologia promettente ed è attualmente oggetto di studio attivo da parte di molte aziende, paesi e gruppi di ricerca. Il protocollo qui presentato impiega stampi personalizzati, riutilizzabili e stampati in 3D per il trattamento MICP a flusso continuo di terreno o sabbia, producendo mattoni cilindrici che soddisfano le specifiche standard per i test di compressione non confinati. Gli stampi individuali, autoportanti e ricoperti da serbatoio, consentono un comodo test parallelo di più variabili e repliche. Questo protocollo delinea la reazione MICP di S. pasteurii e la creazione, l'assemblaggio e l'uso degli stampi stampati in 3D per generare mattoni cilindrici in biocemento.

Introduzione

Il calcestruzzo è il principale materiale da costruzione per progetti di costruzione in tutto il mondo ^1,2. Uno studio ha rilevato che il cemento è il secondo materiale più consumato al mondo, dietro solo all'acqua³. Ogni anno vengono prodotti quasi 4,1 miliardi di tonnellate di cemento ^4,5. La produzione, la lavorazione e l'applicazione tradizionali del cemento determinano quasi l'8% delle emissioni globali di CO₂ all'anno⁶. A causa dell'elevata domanda e degli effetti dannosi della produzione tradizionale di cemento, un nuovo metodo di cementazione a zero emissioni di carbonio è una priorità assoluta per gli obiettivi di sostenibilità globale 7,8,9,10.

La biocementazione è il processo di utilizzo di microrganismi per produrre un cemento, un adesivo o una sostanza che può essere utilizzata per creare una superficie solida o una struttura ^1,11. Il processo di biocementazione più ben definito prevede l'utilizzo di batteri ureolitici per precipitare il carbonato di calcio, legando le particelle in un materiale cementizio indurito^12,13.

Quando si considera un'alternativa ecologica al cemento tradizionale, l'alternativa deve anche soddisfare le aspettative di resistenza del cemento. Il test di compressione non confinato è una misura analitica utilizzata per determinare la resistenza al taglio di una roccia, di un materiale da costruzione o di un campione di terreno¹⁴. Per prove di taglio efficaci, il campione deve essere preparato secondo gli standard del settore, che includono un rapporto diametro/altezza 1:2 e una forma cilindrica¹⁵. È stato creato uno stampo stampato in 3D progettato su misura per soddisfare questi standard e aumentare l'efficienza nell'esecuzione di un protocollo MICP. Questi stampi progettati su misura consentono l'applicazione a flusso continuo e il drenaggio di trattamenti MICP sequenziali. La coltura batterica e la soluzione di cementazione possono essere facilmente applicate al serbatoio superiore, che poi scorre attraverso lo stampo e passa attraverso un'apertura foderata in rete sulla base dello stampo. Gli stampi sono progettati per essere appoggiati sopra un becher o un altro contenitore per la raccolta dei rifiuti. Lo stampo è diviso a metà verticalmente per consentire una facile sformatura del mattone cementato. È tenuto insieme da otto magneti fissati al telaio dello stampo e sigillato con resina epossidica per evitare danni ai magneti dovuti all'esposizione alle soluzioni MICP. Le due metà contengono anche una scanalatura interna per posizionare una guarnizione in gomma, che aiuta a sigillare lo stampo e prevenire perdite. All'interno dello stampo cilindrico c'è una scanalatura per indicare il livello di riempimento di sabbia/terra per produrre un mattone di 3 pollici di altezza; Lo spazio al di sopra di tale scanalatura è destinato ad essere utilizzato come serbatoio per l'applicazione di soluzioni di trattamento. Un pezzo di rete metallica posizionato sopra l'apertura inferiore all'interno dello stampo, una volta costruito, impedisce alla sabbia o al terreno di cadere attraverso il fondo dello stampo. Inoltre, un pezzo di rete metallica viene posizionato sulla parte superiore della sabbia o del terreno per aiutare a distribuire uniformemente le soluzioni applicate e garantire che il mattone che si forma abbia una parte superiore uniforme senza creste taglienti, che potrebbero influire sui risultati del test di compressione non confinato.

Gli stampi sono stati progettati utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design) e dal file CAD (File supplementare 1 e File supplementare 2) è stato generato un file STL (File supplementare 3 e File supplementare 4). Questo file STL è stato caricato nel programma di stampa 3D e successivamente stampato. Dopo che gli stampi sono stati stampati, è stato utilizzato un sistema a getto d'acqua per rimuovere il materiale di supporto generato dalla stampante 3D, lasciando la struttura finale stampata in 3D. È stato incluso anche il file per la stampa di un dispositivo di pressatura per aiutare a compattare la sabbia/terra nello stampo e creare una superficie superiore piana.

Protocollo

I dettagli dei reagenti, delle attrezzature e del software utilizzati sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione di soluzioni e terreni

1. Infuso cervello-cuore (BHI) - terreno di urea (1 L)
   1. Pesare 37 g di polvere di BHI utilizzando una bilancia e aggiungerla a un pallone o a un becher da 1 L.
   2. Pesare 20 g di urea utilizzando una bilancia e aggiungere allo stesso pallone o becher da 1 litro contenente polvere di BHI.
      ATTENZIONE: Non sterilizzare in autoclave o aggiungere candeggina a materiali contenenti urea. L'urea si scompone in ammoniaca, che può essere dannosa come gas volatilizzato e può reagire con la candeggina per formare gas mostarda tossico. Smaltire tutti i rifiuti come rifiuti pericolosi secondo i protocolli di sicurezza dell'istituto.
   3. Riempire il pallone o il becher da 1 L contenente BHI in polvere e urea con 1 L di H₂O.
   4. Miscelare e filtrare sterilizzare il mezzo con un filtro da 0,45 μM in un matraccio o becher autoclavato.
2. Soluzione di cementazione (1 L)
   1. Pesare 20 g di urea con una bilancia e aggiungerla a un pallone o a un becher da 1 L.
   2. Pesare 10 g di NH₄Cl (cloruro di ammonio) utilizzando una bilancia e aggiungere allo stesso pallone o becher da 1 L contenente urea.
      ATTENZIONE: Non sterilizzare in autoclave o aggiungere candeggina a materiali contenenti cloruro di ammonio. Il cloruro di ammonio formerà un equilibrio con l'ammoniaca gassosa, che può essere dannosa come gas volatilizzato e può reagire con la candeggina per formare gas mostarda tossico. Smaltisci tutti i rifiuti come rifiuti pericolosi secondo i protocolli di sicurezza del tuo istituto.
   3. Pesare 49 g di CaCl_{4.2H 2}O (cloruro di calcio) utilizzando una bilancia e aggiungere allo stesso pallone o becher da 1 L contenente urea e cloruro di ammonio.
   4. Riempire il pallone o il becher da 1 L contenente urea, cloruro di ammonio e cloruro di calcio con 1 L di H₂O.
      NOTA: Questa soluzione non è sterilizzata; Preparare fresco e consumare entro 48 ore.
3. Stampa e preparazione dei mattoni (eseguita alcuni giorni prima del trattamento MICP)
   1. Caricare il file STL per lo stampo in mattoni (File supplementare 1) e il dispositivo di rincalzatura (File supplementare 2) nel programma appropriato per la stampante 3D.
      NOTA: Il programma specifico utilizzato potrebbe essere diverso utilizzando una stampante 3D diversa. Utilizzare il programma appropriato per la stampante in uso.
   2. Stampa gli stampi e i dispositivi di rincalzatura (Figura 1).
   3. Elaborare gli stampi in base ai requisiti della stampante.
   4. Posizionare un magnete in ciascuna delle fessure del magnete appropriate nello stampo, assicurandosi che le cariche siano posizionate in modo tale che le due metà dello stampo si attraggano e non si respingano a vicenda
   5. Una volta posizionati correttamente i magneti, sigillare ogni magnete con resina epossidica.
   6. Seleziona due cerchi di rete metallica da 1.5 pollici di diametro e mettili da parte.

2. Preparazione dei mattoni (Giorno 0)

NOTA: I dettagli per la preparazione di un mattone sono forniti qui.

1. Sterilizzare con filtro 150 mL di terreno BHI-urea. Autoclave un pallone da 250 mL.
2. Preparare 250 mL di soluzione cementizia; non metterlo nel pallone da 250 ml sterilizzato in autoclave.
3. Preparare la coltura di striature isolate di S. pasteurii su una piastra di Petri con agar urea BHI e incubare a 30° C per 24-48 ore (S. pasteurii da stock di glicerolo congelato).
4. Coltura starter di S. pasteurii (Giorno 1)
   1. Preparare una coltura starter da 1,6 mL aggiungendo 1,6 mL di terreno BHI-Urea a una provetta di coltura.
   2. Inoculare la coltura con 1 colonia dalla piastra di serie del giorno 0.
   3. Far crescere la coltura starter in uno shaker (150 giri/min) a 30 °C per una notte.
5. Crescita della cultura (Giorno 2)
   1. Ispezionare la coltura starter per confermare la crescita (evidente come aumento della torbidità).
   2. Aggiungere 40 mL di terreno BHI-urea al pallone autoclavato da 250 mL. Versare 1,6 ml di fermenti lattici nel matrasso. Incubare e agitare a 30 °C per 7 ore.
   3. Aggiungere altri 40 ml di terreno BHI-urea al matrasso. Mettere il pallone in uno shaker a 20 ° C per una notte (~16 h).
6. Trattamento con mattoni con S. pasteurii (Giorno 3)
   1. Aggiungere altri 40 ml di terreno BHI-urea al pallone di coltura notturna e continuare a incubare lo S. pasteurii a 20 ° C.
7. Preparare gli stampi per mattoni (Giorno 3) (vedi Figura 2).
   1. Posizionare le guarnizioni in gomma negli appositi spazi sugli stampi. Collegare le due metà degli stampi, assicurandosi che le guarnizioni siano sigillate e che tutti i magneti siano collegati.
   2. Aggiungi un cerchio di rete metallica sottile sul fondo dello stampo cilindrico in mattoni per evitare che la sabbia cada attraverso il foro nello stampo.
   3. Riempi lo stampo con sabbia o altro materiale fino alla linea all'interno dello stampo e tampona con decisione.
   4. Posiziona un altro cerchio di rete metallica sulla parte superiore della sabbia per coprire l'intera superficie superiore e tampona di nuovo.
   5. Posiziona lo stampo sopra un contenitore per rifiuti per raccogliere il flusso.
8. Procedura di trattamento (Giorno 3)
   1. Versare 40 ml di coltura di S. pasteurii sulla sabbia e lasciarla assorbire. Attendere 45 min.
   2. Versare 80 ml di soluzione cementante sulla sabbia. Attendere 30 minuti.
   3. Versare 40 ml di coltura di S. pasteurii sulla sabbia. Attendere 30 minuti.
   4. Versare 80 ml di soluzione cementante sulla sabbia. Attendere 30 minuti.
   5. Versare 40 ml di coltura di S. pasteurii sulla sabbia. Attendere 30 minuti.
   6. Versare 80 ml di soluzione cementante sulla sabbia. Lasciare il mattone da solo per almeno 48 ore o fino a quando la sabbia non appare asciutta.
9. Controlla il prodotto finale (Giorno 5).
   1. Aprire gli stampi con cura dividendo lo stampo a metà e rilasciando la pressione dai magneti. Rimuovere delicatamente il mattone dallo stampo.
      NOTA: Se la sabbia sembra bagnata, lo stampo dovrà asciugarsi per un altro giorno o due prima di rimuovere il mattone dallo stampo (più il mattone è asciutto, più è facile rimuoverlo).
   2. Posiziona il mattone su un tovagliolo di carta per continuare ad asciugare per 3 settimane prima di eseguire il test di compressione.
10. Pulizia degli stampi (Giorno 5)
    1. Una volta rimosso il mattone dallo stampo, separare le guarnizioni e la rete metallica da ciascuna metà dello stampo.
    2. Immergere la rete metallica in una soluzione di etanolo al 70% per 24 ore prima di risciacquare con acqua. Potrebbe essere necessario strofinare leggermente per pulire la rete.
    3. Sciacquare gli stampi con etanolo al 70% e strofinare con una spazzola a setole morbide, una spugna o un altro dispositivo di pulizia almeno 3 volte; Quindi pulire con acqua e sapone seguito da asciugatura all'aria
    4. Sciacquare le guarnizioni con etanolo al 70% e poi pulirle con acqua e sapone, quindi asciugare all'aria.

3. Test di compressione (giorno 25)

1. Analizzare la resistenza di tutti i mattoni utilizzando un test di compressione non confinato¹⁶.
   1. Assicurati che le estremità circolari del mattone siano piatte e uniformi. Se le estremità non sono uniformi, utilizzare una lima o un altro dispositivo per livellare le superfici.
      NOTA: Le estremità del mattone dovrebbero essere per lo più piatte se la rete metallica è stata applicata correttamente. È fondamentale che le estremità del mattone siano il più uniformi possibile per garantire una misurazione accurata della resistenza.
2. Metti un mattone in un sacchetto di plastica con cerniera o sigillato e posiziona il mattoncino nel sacchetto di plastica in modo che le facce piatte del mattone non siano coperte da una cucitura per ottenere una copertura liscia e piatta.
3. Posizionare il mattone sulla piastra di carico inferiore. Posiziona una piastra di carico piatta e uniforme sopra il mattone.
4. Applicare circa 1 libbra di pressione sul mattone tramite la macchina per prove di compressione non confinata.
5. Tarare la lettura digitale.
6. Applicare un carico crescente in modo continuo secondo le specifiche della macchina fino a raggiungere il completo cedimento strutturale del mattone.
7. Registrare il carico massimo portante per ogni mattone. Eseguire l'analisi statistica desiderata per valutare i risultati.

Risultati

La costruzione dello stampo stampato in 3D può essere vista nella Figura 1 e nella Figura 2. I risultati positivi dovrebbero essere visti come un mattone che mantiene la sua forma quando viene rimosso dallo stampo e, dopo 3 settimane di essiccazione, appare come una struttura solida che può essere facilmente maneggiata con una minima perdita di materiale al tatto. Se il mattone non è solido e si verifica uno sgretolamento o u...

Discussione

Passaggi critici
Questo protocollo di biocementazione utilizza S. pasteurii MICP per produrre mattoni cilindrici biocementati adatti per test di compressione non confinati. Uno dei fattori più critici per le prove di compressione non confinate è la forma e la struttura del campione. Assicurarsi che la parte superiore e inferiore del prodotto cilindrico siano piatte e che l'altezza del mattone sia il più vicino possibile a 3 pollici; Superare leggermente l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-Printer	Stratasys	Objet 30 V3	Objet30 Pro V3.0 Desktop 3D-Printer
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04066	Rigur RGD450 Model Material
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04020	Sup 705 Support Material
Ammonium Chloride	Fisher Scientific	A661-500	Any other Ammonium Chloride should work, manufacturer should not matter
Brain Heart Infusion Broth	Millipore	53286	Any other Brain Heart Infusion Broth should work, manufacturer should not matter
Calcium Chloride Dihydrate	VWR	BDH9224	Any other Calcium chloride Dihydrate should work, manufacturer should not matter
Coarse Sand	Ward’s	470016-902	Special Sand-Gravel Mix and Stress Clay
Desktop Water Jet	Stratasys	OBJ-01400	Water jet system for post-processing of 3D prints
Epoxy	Gorilla Glue	4200102	GORILLA Epoxy Adhesive: Epoxy, 0.8 fl oz, Syringe, Clear, Thick Liquid
Fine Sand	Sandtastik	PLA25	Play Sand in Sparkling White
Gasket Material	McMaster-Carr	8525T65	Ethylene-propylene diene monomer (EPDM) 1/16” thickness
GrabCAD	Stratasys	GrabCAD	3D printer software
Magnets	K&J Magnetics	D64-N52	Neodymium Magnet Grade N52
SolidWorks 2021	Dassault Systèmes	SolidWorks 2021	CAD software
Sporosarcina pasteurii			Strain: ATCC 11859 / DSM 33
Vacuum Filtration cup 0.45µm	VWR	10040-450
Wire Mesh 1.5” Diameter Discs	McMaster-Carr	2812T43	Steel Wire Mesh Material