Sınırsız Sıkıştırma Testleri için Özel 3D Baskılı Kalıplar Kullanılarak Sporosarcina pasteurii Biyoçimento Tuğlalarının Üretimi ve Analizi

Özet

Sporosarcina pasteurii , üreyi karbonat ve amonyuma parçalayan ürolitik bir bakteridir. Karbonat, kalsiyum karbonat oluşturmak için kalsiyum ile birleşir ve biyoçimento üretmek için çevredeki parçacıkları birbirine bağlayan bir kristal kafes oluşturur. Bu, sıkıştırma testine uygun biyoçimento tuğlaları oluşturmak için 3D baskılı kalıpları kullanmak için uygun bir protokoldür.

Özet

Çimento, evlerin temellerinden tarihi anıtlara ve yollara kadar dünya çapında birçok yapıda kullanılan önemli bir yapı malzemesidir. Dünya çapında kritik ve bol miktarda bulunan bir malzemedir. Bununla birlikte, geleneksel çimento üretimi, insan yapımı atmosferik CO_2'ye önemli bir katkıda bulunur ve bu da sera gazı emisyonlarına ve iklim değişikliğine yol açar. Mikrobiyal olarak indüklenen kalsit çökeltme (MICP), Sporosarcina pasteurii veya diğer bakterilerin geleneksel çimento kadar güçlü bir çimento malzemesi ürettiği, ancak biyobetonun karbon nötr olduğu biyolojik bir süreçtir. Biyobeton üretmek için bu MICP yöntemi umut verici bir teknolojidir ve şu anda birçok şirket, ülke ve araştırma grubu tarafından aktif olarak araştırılmaktadır. Burada sunulan protokol, toprak veya kumun akışlı MICP işlemi için özel olarak tasarlanmış, yeniden kullanılabilir, 3D baskılı kalıplar kullanır ve sınırlandırılmamış sıkıştırma testleri için standart spesifikasyonları karşılayan silindirik tuğlalar üretir. Bireysel, bağımsız, rezervuar tepeli kalıplar, birden fazla değişkenin ve replikasyonun uygun paralel testine izin verir. Bu protokol, S. pasteurii MICP reaksiyonunu ve biyocement silindirik tuğlalar oluşturmak için 3D baskılı kalıpların oluşturulmasını, montajını ve kullanımını ana hatlarıyla belirtir.

Giriş

Beton, dünya çapında inşaat projeleri için ana yapı malzemesidir ^1,2. Bir çalışma, çimentonun sadece suyun ardından dünyada en çok tüketilen ikinci malzeme olduğunu buldu³. Her yıl yaklaşık 4,1 milyar ton çimento üretilmektedir ^4,5. Çimentonun geleneksel üretimi, işlenmesi ve uygulanması, yıllık küresel CO₂ emisyonlarının yaklaşık %8'ine neden olmaktadır⁶. Geleneksel çimento üretiminin yüksek talebi ve buna rağmen zarar verici etkileri nedeniyle, çimentolama için yeni bir karbon nötr yöntem, küresel sürdürülebilirlik hedefleri ^7,8,9,10 için en önemli önceliktir.

Biyocementasyon, katı bir yüzey veya yapı oluşturmak için kullanılabilecek bir çimento, yapıştırıcı veya madde üretmek için mikroorganizmaları kullanma işlemidir ^1,11. En iyi tanımlanmış biyocementasyon işlemi, kalsiyum karbonatı çökeltmek için ürolitik bakterilerin kullanılmasını ve partiküllerin sertleştirilmiş bir çimento malzemesine^{bağlanmasını içerir 12,13}.

Geleneksel çimentoya çevre dostu bir alternatif düşünüldüğünde, alternatifin çimento için mukavemet beklentilerini de karşılaması gerekir. Sınırsız sıkıştırma testi, bir kayanın, yapı malzemesinin veya toprak numunesinin¹⁴ kesme mukavemetini belirlemek için kullanılan analitik bir ölçümdür. Etkili kesme testi için numune, 1:2 çap-yükseklik oranı ve silindirik bir şekil¹⁵ içeren endüstri standartlarına göre hazırlanmalıdır. Bu standartları karşılamak ve bir MICP protokolünün yürütülmesinde verimliliği artırmak için özel olarak tasarlanmış bir 3D baskılı kalıp oluşturuldu. Bu özel olarak tasarlanmış kalıplar, sıralı MICP işlemlerinin akış yoluyla uygulanmasına ve drenajına izin verir. Bakteri kültürü ve sementasyon çözeltisi, daha sonra kalıbın içinden geçen ve kalıbın tabanındaki ağ kaplı bir açıklıktan geçen üst rezervuara kolayca uygulanabilir. Kalıplar, bir beher veya başka bir atık toplama kabının üzerine dayanacak şekilde tasarlanmıştır. Çimentolu tuğlanın kolayca kalıptan çıkarılmasını sağlamak için kalıp dikey olarak ikiye bölünür. Kalıbın çerçevesine yapıştırılmış sekiz mıknatıs ile bir arada tutulur ve mıknatısların MICP çözeltilerine maruz kalmasından kaynaklanan hasarları önlemek için epoksi ile kapatılır. İki yarım ayrıca, kalıbı sızdırmaz hale getirmeye ve sızıntıyı önlemeye yardımcı olan bir lastik conta yerleştirmek için bir iç oluk içerir. Silindirik kalıbın iç tarafında, 3 inç yüksekliğinde bir tuğla üretmek için kum/toprak için doldurma seviyesini gösteren bir oluk vardır; Bu oluğun üzerindeki boşluğun, arıtma solüsyonlarının uygulanması için bir rezervuar olarak kullanılması amaçlanmıştır. Kalıbın iç kısmındaki alt açıklığın üzerine yerleştirilen bir tel örgü parçası, inşa edildiğinde kum veya toprağın kalıbın altından düşmesini önler. Ek olarak, uygulanan çözeltilerin eşit bir şekilde dağıtılmasına yardımcı olmak ve oluşan tuğlanın, sınırlandırılmamış sıkıştırma testi sonuçlarını etkileyebilecek herhangi bir keskin çıkıntı olmadan düz bir tepeye sahip olmasını sağlamak için kumun veya toprağın üstüne bir tel örgü parçası yerleştirilir.

Kalıplar, bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlandı ve CAD dosyasından (Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 4) bir STL dosyası (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) oluşturuldu. Bu STL dosyası 3D yazıcı programına yüklendi ve ardından yazdırıldı. Kalıplar basıldıktan sonra, 3D yazıcıdan üretilen destek malzemesini çıkarmak için bir su jeti sistemi kullanıldı ve son 3D baskılı yapı bırakıldı. Kalıptaki kumu/toprağı sıkıştırmaya ve düz bir üst yüzey oluşturmaya yardımcı olmak için bir sıkıştırma cihazı yazdırmak için dosya da dahil edilmiştir.

Protokol

Kullanılan reaktiflerin, ekipmanın ve yazılımın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çözeltilerin ve ortamın hazırlanması

1. Beyin-Kalp İnfüzyonu (BHI) - üre ortamı (1 L)
   1. Bir terazi kullanarak 37 g BHI tozunu tartın ve 1 L'lik bir şişeye veya behere ekleyin.
   2. Bir terazi kullanarak 20 g üre tartın ve BHI tozu içeren aynı 1 L'lik şişeye veya behere ekleyin.
      DİKKAT: Üre içeren herhangi bir malzemeye otoklav yapmayın veya ağartıcı eklemeyin. Üre, uçucu bir gaz olarak zararlı olabilen ve zehirli hardal gazı oluşturmak için ağartıcı ile reaksiyona girebilen amonyağa parçalanır. Tüm atıkları kurumun güvenlik protokollerine göre tehlikeli atık olarak atın.
   3. BHI tozu ve üre içeren 1 L'lik şişeyi veya kabı 1 L_H2Oile doldurun.
   4. Karıştırın ve filtreleyin: ortamı 0.45 μM'lik bir filtre ile otoklavlanmış bir şişe veya behere sterilize edin.
2. Sementasyon çözeltisi (1 L)
   1. Bir terazi kullanarak 20 g üre tartın ve 1 L'lik bir şişeye veya behere ekleyin.
   2. Bir terazi kullanarak 10 g_NH4Cl (amonyum klorür) tartın ve üre içeren aynı 1 L'lik şişeye veya behere ekleyin.
      DİKKAT: Amonyum klorür içeren herhangi bir malzemeye otoklav yapmayın veya ağartıcı eklemeyin. Amonyum klorür, uçucu bir gaz olarak zararlı olabilen ve zehirli hardal gazı oluşturmak için ağartıcı ile reaksiyona girebilen amonyak gazı ile bir denge oluşturacaktır. Tüm atıkları kurumunuzun güvenlik protokollerine göre tehlikeli atık olarak atın.
   3. Bir terazi kullanarak 49 g CaCl_{4.2H 2}O (kalsiyum klorür) tartın ve üre ve amonyum klorür içeren aynı 1 L'lik şişeye veya behere ekleyin.
   4. Üre, amonyum klorür ve kalsiyum klorür içeren 1 L'lik şişeyi veya kabı 1 L H₂O ile doldurun.
      NOT: Bu çözelti sterilize edilmemiştir; Taze hazırlayın ve 48 saat içinde kullanın.
3. Tuğla baskı ve hazırlama (MICP işleminden birkaç gün önce yapılır)
   1. Tuğla kalıbı için STL dosyasını (Ek Dosya 1) ve sıkıştırma cihazını (Ek Dosya 2) 3D yazıcı için uygun programa yükleyin.
      NOT: Kullanılan belirli program, farklı bir 3D yazıcı kullanılarak farklı olabilir. Kullanmakta olduğunuz yazıcı için uygun programı kullanın.
   2. Kalıpları ve sıkıştırma cihazlarını yazdırın (Şekil 1).
   3. Kalıpları yazıcı gereksinimlerine göre işleyin.
   4. Kalıptaki uygun mıknatıs yuvalarının her birine bir mıknatıs yerleştirin, yüklerin kalıbın iki yarısı birbirini çekecek ve itmeyecek şekilde yerleştirildiğinden emin olun
   5. Mıknatıslar uygun şekilde yerleştirildikten sonra, her bir mıknatısı epoksi ile kapatın.
   6. İki adet 1,5 inç çapında tel örgü çemberi seçin ve bir kenara koyun.

2. Tuğla hazırlama (Gün 0)

NOT: Bir tuğlanın hazırlanması ile ilgili detaylar burada verilmiştir.

1. Filtre, 150 mL BHI-üre ortamını sterilize eder. 250 mL'lik bir şişeyi otoklavlayın.
2. 250 mL çimentolama çözeltisi hazırlayın; otoklavlanmış 250 mL'lik şişeye koymayın.
3. BHI üre agar içeren bir Petri kabı üzerinde S. pasteurii izole çizgi kültürü hazırlayın ve 30 ° C'de 24-48 saat inkübe edin (donmuş gliserol stoğundan S. pasteurii ).
4. S. pasteurii başlangıç kültürü (1. Gün)
   1. Bir kültür tüpüne 1.6 mL BHI-Üre ortamı ekleyerek 1.6 mL'lik bir başlangıç kültürü yapın.
   2. Kültürü, Gün 0 çizgi plakasından 1 koloni ile aşılayın.
   3. Başlangıç kültürünü gece boyunca 30 °C'de bir çalkalayıcıda (150 rpm) büyütün.
5. Kültür büyümesi (2. gün)
   1. Büyümeyi doğrulamak için başlangıç kültürünü inceleyin (artan bulanıklık olarak belirgindir).
   2. 250 mL otoklavlanmış şişeye 40 mL BHI-üre ortamı ekleyin. 1.6 mL başlangıç kültürünü şişeye dökün. 30 °C'de 7 saat inkübe edin ve çalkalayın.
   3. Şişeye 40 mL daha BHI-üre ortamı ekleyin. Şişeyi gece boyunca (~ 20 saat) 16 ° C'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
6. S. pasteurii ile tuğla tedavisi (3. Gün)
   1. Gece boyunca kültür şişesine 40 mL ilave bir BHI-üre ortamı ekleyin ve S. pasteurii'yi 20 ° C'de inkübe etmeye devam edin.
7. Tuğla kalıpları hazırlayın (3. Gün) (bkz. Şekil 2).
   1. Lastik contaları kalıpların üzerindeki uygun boşluklara yerleştirin. Contaların sızdırmaz olduğundan ve tüm mıknatısların bağlandığından emin olarak kalıpların iki yarısını bağlayın.
   2. Kumun kalıptaki delikten düşmesini önlemek için silindirik tuğla kalıbın altına bir daire ince tel örgü ekleyin.
   3. Kalıbı, kalıbın iç kısmındaki çizgiye kadar kum veya başka bir malzeme ile doldurun ve sıkıca bastırın.
   4. Tüm üst yüzeyi kaplamak için kumun üstüne başka bir tel örgü çemberi yerleştirin ve tekrar sıkıştırın.
   5. Akışı yakalamak için kalıbı bir atık kabının üzerine yerleştirin.
8. Tedavi prosedürü (3. Gün)
   1. Kumun üzerine 40 mL S. pasteurii kültürü dökün ve ıslanmasına izin verin. 45 dakika bekleyin.
   2. Kumun üzerine 80 mL çimentolama solüsyonu dökün. 30 dakika bekleyin.
   3. Kumun üzerine 40 mL S. pasteurii kültürü dökün. 30 dakika bekleyin.
   4. Kumun üzerine 80 mL çimentolama solüsyonu dökün. 30 dakika bekleyin.
   5. Kumun üzerine 40 mL S. pasteurii kültürü dökün. 30 dakika bekleyin.
   6. Kumun üzerine 80 mL çimentolama solüsyonu dökün. Tuğlayı en az 48 saat veya kum kuru görünene kadar yalnız bırakın.
9. Nihai ürünü kontrol edin (5. Gün).
   1. Kalıbı ikiye bölerek ve mıknatıslardan gelen basıncı serbest bırakarak kalıpları dikkatlice açın. Tuğlayı yavaşça kalıptan çıkarın.
      NOT: Kum ıslak görünüyorsa, tuğlayı kalıptan çıkarmadan önce kalıbın bir veya iki gün daha kuruması gerekecektir (tuğla ne kadar kuru olursa, çıkarılması o kadar kolay olur).
   2. Sıkıştırma testi yapmadan önce 3 hafta kurumaya devam etmek için tuğlayı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
10. Küflerin temizlenmesi (5.Gün)
    1. Tuğla kalıptan çıkarıldıktan sonra, contaları ve tel örgüyü kalıbın her iki yarısından ayırın.
    2. Su ile durulamadan önce tel örgüyü 24 saat boyunca %70 etanol içeren bir çözeltiye batırın. Ağı temizlemek için hafif ovma gerekebilir.
    3. Kalıpları %70 etanol ile durulayın ve yumuşak kıllı bir fırça, sünger veya başka bir temizleme cihazı ile en az 3 kez ovalayın; Daha sonra sabun ve su ile temizleyin ve ardından havayla kurutun
    4. Contaları %70 etanol ile durulayın ve ardından sabun ve suyla temizleyin, ardından havayla kurutun.

3. Sıkıştırma testi (25. Gün)

1. Sınırsız bir sıkıştırma testi¹⁶ kullanarak tüm tuğlaları mukavemet açısından analiz edin.
   1. Tuğlanın dairesel uçlarının düz ve eşit olduğundan emin olun. Uçlar düz değilse, yüzeyleri düzleştirmek için bir dosya veya başka bir cihaz kullanın.
      NOT: Tel örgü doğru uygulanmışsa, tuğlanın uçları çoğunlukla düz olmalıdır. Doğru bir mukavemet ölçümü sağlamak için tuğlanın uçlarının mümkün olduğunca eşit olması çok önemlidir.
2. Fermuarlı veya kapalı bir plastik torbaya bir tuğla yerleştirin ve tuğlayı, pürüzsüz, düz bir kapsama alanı elde etmek için tuğlanın düz yüzleri bir dikişle örtülmeyecek şekilde plastik torbaya yerleştirin.
3. Tuğlayı alt yükleme plakasına yerleştirin. Tuğlanın üzerine düz ve eşit bir yükleme plakası yerleştirin.
4. Sınırlandırılmamış sıkıştırma test makinesi ile tuğlaya yaklaşık 1 pound basınç uygulayın.
5. Dijital okumanın darasını alın.
6. Tuğlanın tamamen yapısal arızası elde edilene kadar makine özelliklerine göre sürekli olarak artan yük uygulayın.
7. Her tuğla için maksimum ağırlık taşıma yükünü kaydedin. Sonuçları değerlendirmek için istenen istatistiksel analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar

3D baskılı kalıbın yapısı Şekil 1 ve Şekil 2'de görülebilir. Olumlu sonuçlar, kalıptan çıkarıldığında şeklini koruyan ve 3 haftalık kurumayı takiben, dokunmadan minimum malzeme kaybıyla kolayca işlenebilen sağlam bir yapı olarak görünen bir tuğla olarak görülmelidir. Tuğla sağlam değilse ve dokunma veya hareketten dolayı ufalanma veya önemli malzeme kaybı varsa, ortam veya kültür hazırlığ...

Tartışmalar

Kritik adımlar
Bu biyocementasyon protokolü, sınırlandırılmamış sıkıştırma testi için uygun olan biyoçimentolu silindirik tuğlalar üretmek için S. pasteurii MICP'yi kullanır. Sınırsız sıkıştırma testi için en kritik faktörlerden biri, numunenin şekli ve yapısıdır. Silindir ürününün üst ve alt kısmının düz olduğundan ve tuğla yüksekliğinin mümkün olduğunca 3 inç'e yakın olduğundan emin olun; 3 inçlik yüksekli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-Printer	Stratasys	Objet 30 V3	Objet30 Pro V3.0 Desktop 3D-Printer
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04066	Rigur RGD450 Model Material
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04020	Sup 705 Support Material
Ammonium Chloride	Fisher Scientific	A661-500	Any other Ammonium Chloride should work, manufacturer should not matter
Brain Heart Infusion Broth	Millipore	53286	Any other Brain Heart Infusion Broth should work, manufacturer should not matter
Calcium Chloride Dihydrate	VWR	BDH9224	Any other Calcium chloride Dihydrate should work, manufacturer should not matter
Coarse Sand	Ward’s	470016-902	Special Sand-Gravel Mix and Stress Clay
Desktop Water Jet	Stratasys	OBJ-01400	Water jet system for post-processing of 3D prints
Epoxy	Gorilla Glue	4200102	GORILLA Epoxy Adhesive: Epoxy, 0.8 fl oz, Syringe, Clear, Thick Liquid
Fine Sand	Sandtastik	PLA25	Play Sand in Sparkling White
Gasket Material	McMaster-Carr	8525T65	Ethylene-propylene diene monomer (EPDM) 1/16” thickness
GrabCAD	Stratasys	GrabCAD	3D printer software
Magnets	K&J Magnetics	D64-N52	Neodymium Magnet Grade N52
SolidWorks 2021	Dassault Systèmes	SolidWorks 2021	CAD software
Sporosarcina pasteurii			Strain: ATCC 11859 / DSM 33
Vacuum Filtration cup 0.45µm	VWR	10040-450
Wire Mesh 1.5” Diameter Discs	McMaster-Carr	2812T43	Steel Wire Mesh Material