ייצור וניתוח של לבני ביו-צמנט של Sporosarcina pasteurii באמצעות תבניות מודפסות בתלת מימד מותאמות אישית לבדיקות דחיסה בלתי מוגבלות

Summary

Sporosarcina pasteurii הוא חיידק אוראוליטי המפרק אוריאה לקרבונט ואמוניום. הקרבונט משתלב עם סידן ליצירת סידן פחמתי, ויוצר סריג גבישי המעגן את החלקיקים הסובבים יחד לייצור ביו-צמנט. זהו פרוטוקול נוח לשימוש בתבניות מודפסות בתלת מימד ליצירת לבני ביו-צמנט המתאימות לבדיקת דחיסה.

Abstract

מלט הוא חומר בנייה מרכזי המשמש במבנים רבים ברחבי העולם, החל מיסודות לבתים ועד מונומנטים היסטוריים וכבישים. זהו חומר קריטי ושופע ברחבי העולם. עם זאת, הייצור המסורתי של מלט הוא תורם מרכזי ל-CO2 אטמוספרי מעשה ידי אדם, מה שמוביל לפליטת גזי חממה ושינויי אקלים. משקעי קלציט המושרים מיקרוביאלית (MICP) הוא תהליך ביולוגי שבו Sporosarcina pasteurii או חיידקים אחרים מייצרים חומר מלט חזק כמו מלט מסורתי, אך ביו-צמנט הוא ניטרלי מבחינת פחמן. שיטת MICP זו לייצור ביו-צמנט היא טכנולוגיה מבטיחה ונמצאת כיום תחת חקירה פעילה על ידי חברות, מדינות וקבוצות מחקר רבות. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בתבניות מעוצבות בהתאמה אישית, לשימוש חוזר, מודפסות בתלת מימד לטיפול MICP זורם באדמה או בחול, ומייצרות לבנים גליליות העומדות במפרט סטנדרטי לבדיקות דחיסה בלתי מוגבלות. התבניות הבודדות, העומדות בפני עצמן, עם ראש המאגר מאפשרות בדיקה מקבילה נוחה של משתנים מרובים ומשכפלים. פרוטוקול זה מתאר את תגובת S. pasteurii MICP ואת היצירה, ההרכבה והשימוש בתבניות המודפסות בתלת מימד ליצירת לבנים גליליות ביו-צמנטיות.

Introduction

בטון הוא חומר הבנייה העיקרי לפרויקטי בנייה ברחבי העולם ^1,2. מחקר אחד מצא כי מלט הוא החומר השני הנצרך ביותר בעולם,^{אחרי מים בלבד}. כמעט 4.1 מיליארד טון מלט מיוצרים מדי שנה ^4,5. ייצור, עיבוד ויישום מסורתיים של מלט מביאים לכמעט 8% מפליטות ה-CO2 העולמיות מדי שנה⁶. בשל הביקוש הרב וההשפעות המזיקות של ייצור מלט מסורתי, שיטה חדשה ניטרלית פחמן למלט היא בראש סדר העדיפויות של יעדי הקיימות העולמיים 7,8,9,10.

ביו-צמנטציה היא תהליך של שימוש במיקרואורגניזמים לייצור מלט, דבק או חומר שניתן להשתמש בו ליצירת משטח או מבנה מוצק ^1,11. תהליך הביו-צמנטציה המוגדר ביותר כולל שימוש בחיידקים אוראוליטיים כדי לזרז סידן פחמתי, תוך קישור חלקיקים יחד לחומר מלט מוקשה^12,13.

כאשר בוחנים אלטרנטיבה ידידותית לסביבה למלט מסורתי, החלופה חייבת לעמוד גם בציפיות החוזק למלט. בדיקת הדחיסה הבלתי מוגבלת היא מדידה אנליטית המשמשת לקביעת חוזק הגזירה של סלע, חומר בניין או דגימת אדמה¹⁴. לבדיקת גזירה יעילה, יש להכין את הדגימה על פי תקני התעשייה, הכוללים יחס קוטר לגובה של 1:2 וצורה גלילית¹⁵. תבנית מודפסת בתלת מימד בהתאמה אישית נוצרה כדי לעמוד בתקנים אלה ולהגביר את היעילות בביצוע פרוטוקול MICP. תבניות מעוצבות בהתאמה אישית אלה מאפשרות יישום זרימה וניקוז של טיפולי MICP עוקבים. ניתן ליישם בקלות תרבית חיידקים ותמיסת מלט על המאגר העליון, אשר לאחר מכן עובר דרך התבנית ועובר דרך פתח מרופד רשת בבסיס התבנית. התבניות נועדו לנוח על גבי או מיכל איסוף פסולת אחר. התבנית מפוצלת לשניים אנכית כדי לאפשר פירוק קל של הלבנים המלטות. הוא מוחזק יחד על ידי שמונה מגנטים המוצמדים למסגרת התבנית ואטומים באפוקסי כדי למנוע נזק למגנטים מחשיפה לתמיסות MICP. שני החצאים מכילים גם חריץ משובץ להצבת אטם גומי, המסייע לאטום את התבנית ולמנוע דליפה. בחלק הפנימי של התבנית הגלילית יש חריץ המציין את מפלס המילוי של חול/אדמה לייצור לבנה בגובה 3 סנטימטרים; החלל שמעל החריץ הזה נועד לשמש כמאגר ליישום פתרונות טיפול. חתיכת רשת תיל המונחת מעל הפתח התחתון בחלק הפנימי של התבנית, כאשר היא נבנית, מונעת מהחול או האדמה ליפול דרך תחתית התבנית. בנוסף, פיסת רשת תיל מונחת על החלק העליון של החול או האדמה כדי לסייע בפיזור שווה של התמיסות המיושמות ולהבטיח שללבנה שנוצרת יש חלק עליון אחיד ללא רכסים חדים, מה שעלול להשפיע על תוצאות בדיקת הדחיסה הבלתי מוגבלת.

התבניות תוכננו באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD), וקובץ STL (קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2) נוצר מקובץ ה-CAD (קובץ משלים 3 וקובץ משלים 4). קובץ STL זה הועלה לתוכנית מדפסת התלת מימד והודפס לאחר מכן. לאחר הדפסת התבניות, נעשה שימוש במערכת סילון מים כדי להסיר את חומר התמיכה שנוצר ממדפסת התלת מימד, והשאיר את המבנה הסופי המודפס בתלת מימד. כמו כן נכלל הקובץ להדפסת מכשיר הידוק המסייע בדחיסת החול/אדמה בתבנית ויצירת משטח עליון ישר.

Protocol

פרטי הריאגנטים, הציוד והתוכנה המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת פתרונות ומדיה

1. עירוי מוח-לב (BHI) - אוריאה בינונית (1 ליטר)
   1. שקלו 37 גרם אבקת BHI בעזרת איזון והוסיפו לבקבוק או של 1 ליטר.
   2. שקלו 20 גרם אוריאה בעזרת איזון והוסיפו לאותו בקבוק או בנפח 1 ליטר המכילים אבקת BHI.
      זהירות: אין לבצע חיטוי או להוסיף אקונומיקה לחומרים המכילים אוריאה. אוריאה תתפרק לאמוניה, שעלולה להזיק כגז נדיף ויכולה להגיב עם אקונומיקה ליצירת גז חרדל רעיל. השלך את כל הפסולת כפסולת מסוכנת לפי פרוטוקולי הבטיחות של המוסד.
   3. מלאו את בקבוק או הכוס בנפח 1 ליטר המכילים אבקת BHI ואוריאה ב-1 ליטר של H₂O.
   4. מערבבים ומסננים מעקרים את המדיום בעזרת פילטר של 0.45 מיקרומטר לבקבוק או חיטוי.
2. תמיסת צמנטציה (1 ליטר)
   1. שוקלים 20 גרם אוריאה בעזרת איזון ומוסיפים לבקבוק או של 1 ליטר.
   2. שקלו 10 גרם של NH₄Cl (אמוניום כלוריד) בעזרת איזון והוסיפו לאותו בקבוק או בנפח 1 ליטר המכילים אוריאה.
      זהירות: אין לבצע חיטוי או להוסיף אקונומיקה לחומרים המכילים אמוניום כלוריד. אמוניום כלוריד ייצור שיווי משקל עם גז אמוניה, שעלול להזיק כגז נדיף ויכול להגיב עם אקונומיקה ליצירת גז חרדל רעיל. השלך את כל הפסולת כפסולת מסוכנת לפי פרוטוקולי הבטיחות של המוסד שלך.
   3. שקלו 49 גרם CaCl_{4.2H 2}O (סידן כלורי) בעזרת איזון והוסיפו לאותו בקבוק או בנפח 1 ליטר המכילים אוריאה ואמוניום כלוריד.
   4. מלאו את הבקבוק או הכוס בנפח 1 ליטר המכילים אוריאה, אמוניום כלוריד וסידן כלורי ב-1 ליטר של H₂O.
      הערה: תמיסה זו אינה מעוקרת; יש להכין טרי ולהשתמש תוך 48 שעות.
3. הדפסת לבנים והכנתה (מבוצעת מספר ימים לפני הטיפול ב-MICP)
   1. טען את קובץ ה-STL עבור תבנית הלבנים (קובץ משלים 1) ואת התקן ההידוק (קובץ משלים 2) לתוכנית המתאימה למדפסת התלת מימד.
      הערה: התוכנית הספציפית שבה נעשה שימוש עשויה להיות שונה במדפסת תלת-ממד אחרת. השתמש בתוכנית המתאימה למדפסת שבה אתה משתמש.
   2. הדפס את התבניות והתקני ההידוק (איור 1).
   3. עבדו את התבניות בהתאם לדרישות המדפסת.
   4. הנח מגנט אחד בכל אחד מחריצי המגנט המתאימים בתבנית, וודא שהמטענים ממוקמים בצורה כזו ששני חצאי התבנית מושכים ולא דוחים זה את זה
   5. לאחר שהמגנטים ממוקמים כראוי, אטמו כל מגנט באפוקסי.
   6. בחר שני עיגולים בקוטר 1.5 אינץ 'של רשת תיל והניח בצד.

2. הכנת לבנים (יום 0)

הערה: הפרטים להכנת לבנה אחת מסופקים כאן.

1. מסנן לעקר 150 מ"ל של מדיום BHI-urea. חיטוי בקבוק 250 מ"ל.
2. הכן 250 מ"ל של תמיסת מלט; אל תניח אותו בבקבוק החיטוי של 250 מ"ל.
3. מכינים תרבית פסים מבודדת של S. pasteurii על צלחת פטרי עם אגר אוריאה BHI ודוגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות (S. pasteurii מציר גליצרול קפוא).
4. תרבות ההתחלה של S. pasteurii (יום 1)
   1. הכינו תרבית התחלה של 1.6 מ"ל על ידי הוספת 1.6 מ"ל של מדיום BHI-Urea לצינור תרבית.
   2. חסנו את התרבות עם מושבה אחת מצלחת הפס של יום 0.
   3. גדלו את תרבית המנה הראשונה בשייקר (150 סל"ד) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. צמיחה תרבותית (יום 2)
   1. בדוק את תרבות המתנע כדי לאשר צמיחה (ניכרת כעכירות מוגברת).
   2. הוסף 40 מ"ל של מדיום BHI-urea לבקבוק החיטוי של 250 מ"ל. שופכים את תרבית המתנע של 1.6 מ"ל לבקבוק. יש לדגור ולנער בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 7 שעות.
   3. הוסף 40 מ"ל נוספים של מדיום BHI-urea לבקבוק. מניחים את הבקבוק בשייקר בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה (~ 16 שעות).
6. טיפול בלבנים עם S. pasteurii (יום 3)
   1. הוסף 40 מ"ל נוספים של מדיום BHI-urea לבקבוק התרבות הלילה והמשיך לדגור את ה- S. pasteurii בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
7. הכן תבניות לבנים (יום 3) (ראה איור 2).
   1. הנח אטמי גומי בחללים המתאימים על התבניות. חבר את שני חצאי התבניות, וודא שהאטמים אטומים וכל המגנטים מתחברים.
   2. הוסף עיגול של רשת תיל דקה לתחתית תבנית הלבנים הגלילית כדי למנוע מהחול ליפול דרך החור בתבנית.
   3. ממלאים את התבנית בחול או בחומר אחר עד לקו בחלק הפנימי של התבנית ומהדקים היטב.
   4. הניחו עיגול נוסף של רשת תיל על החלק העליון של החול כדי לכסות את כל המשטח העליון ולהדביק שוב.
   5. הניחו את התבנית על גבי מיכל פסולת כדי לתפוס את הזרימה.
8. הליך הטיפול (יום 3)
   1. יוצקים 40 מ"ל של תרבית S. pasteurii על גבי החול ומניחים לו להיספג פנימה. המתן 45 דקות.
   2. יוצקים 80 מ"ל תמיסת מלט על גבי החול. המתן 30 דקות.
   3. יוצקים 40 מ"ל של תרבית S. pasteurii על גבי החול. המתן 30 דקות.
   4. יוצקים 80 מ"ל תמיסת מלט על גבי החול. המתן 30 דקות.
   5. יוצקים 40 מ"ל של תרבית S. pasteurii על גבי החול. המתן 30 דקות.
   6. יוצקים 80 מ"ל תמיסת מלט על גבי החול. השאירו את הלבנה לבד למשך 48 שעות לפחות או עד שהחול נראה יבש.
9. בדוק את המוצר הסופי (יום 5).
   1. פתח את התבניות בזהירות על ידי פיצול התבנית לשניים ושחרור הלחץ מהמגנטים. הסר בעדינות את הלבנה מהתבנית.
      הערה: אם החול נראה רטוב, התבנית תצטרך להתייבש עוד יום-יומיים לפני הוצאת הלבנה מהתבנית (ככל שהלבנה יבשה יותר, כך קל יותר להסיר אותה).
   2. הניחו את הלבנה על מגבת נייר כדי להמשיך להתייבש במשך 3 שבועות לפני ביצוע בדיקות דחיסה.
10. ניקוי תבניות (יום 5)
    1. לאחר הוצאת הלבנה מהתבנית, הפרד את האטמים ורשת התיל מכל מחצית התבנית.
    2. משרים את רשת התיל בתמיסה של 70% אתנול למשך 24 שעות לפני השטיפה במים. ייתכן שיידרש קרצוף קל כדי לנקות את הרשת.
    3. שוטפים את התבניות עם 70% אתנול ושפשפו בעזרת מברשת זיפים רכה, ספוג או מכשיר ניקוי אחר לפחות 3 פעמים; לאחר מכן נקו במים וסבון ולאחר מכן ייבוש באוויר
    4. שטפו את האטמים עם 70% אתנול ולאחר מכן נקו אותם במים וסבון, ולאחר מכן ייבוש באוויר.

3. בדיקת דחיסה (יום 25)

1. נתח את כל הלבנים לחוזק באמצעות מבחן דחיסה בלתי מוגבל¹⁶.
   1. ודא שהקצוות העגולים של הלבנה שטוחים ואחידים. אם הקצוות אינם אחידים, השתמש בקובץ או במכשיר אחר כדי ליישר את המשטחים.
      הערה: קצות הלבנה צריכים להיות שטוחים ברובם אם רשת התיל הוחלה כהלכה. זה קריטי שקצות הלבנה יהיו אחידים ככל האפשר כדי להבטיח מדידה מדויקת של חוזק.
2. הניחו לבנה בשקית ניילון עם רוכסן או אטום ומקמו את הלבנה בשקית הניילון כך שהפנים השטוחות של הלבנה לא יכוסו בתפר כדי להשיג כיסוי חלק ושטוח.
3. הנח את הלבנה על צלחת הטעינה התחתונה. הניחו צלחת טעינה שטוחה ואחידה על גבי הלבנה.
4. הפעל כקילו אחד של לחץ על הלבנה באמצעות מכונת בדיקת הדחיסה הבלתי מוגבלת.
5. טרה את הקריאה הדיגיטלית.
6. הפעל עומס הולך וגובר ברציפות על פי מפרט המכונה עד להשגת כשל מבני מוחלט של הלבנה.
7. רשום את העומס המרבי הנושא משקל עבור כל לבנה. לבצע ניתוח סטטיסטי רצוי להערכת התוצאות.

תוצאות

ניתן לראות את בניית התבנית המודפסת בתלת מימד באיור 1 ובאיור 2. יש לראות תוצאות חיוביות כלבנה השומרת על צורתה כאשר היא מוסרת מהתבנית, ולאחר 3 שבועות של ייבוש, מופיעה כמבנה מוצק שניתן לטפל בו בקלות עם אובדן חומר מינימלי ממגע. אם הלבנה אינה מוצ?...

Discussion

שלבים קריטיים
פרוטוקול ביו-צמנטציה זה משתמש ב-S. pasteurii MICP לייצור לבנים גליליות ביו-צמנטיות המתאימות לבדיקת דחיסה לא מוגבלת. אחד הגורמים הקריטיים ביותר לבדיקת דחיסה בלתי מוגבלת הוא הצורה והמבנה של המדגם. ודא שהחלק העליון והתחתון של מוצר הצילינדר שטוחים וגו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-Printer	Stratasys	Objet 30 V3	Objet30 Pro V3.0 Desktop 3D-Printer
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04066	Rigur RGD450 Model Material
3D-Printer Material	Stratasys	OBJ-04020	Sup 705 Support Material
Ammonium Chloride	Fisher Scientific	A661-500	Any other Ammonium Chloride should work, manufacturer should not matter
Brain Heart Infusion Broth	Millipore	53286	Any other Brain Heart Infusion Broth should work, manufacturer should not matter
Calcium Chloride Dihydrate	VWR	BDH9224	Any other Calcium chloride Dihydrate should work, manufacturer should not matter
Coarse Sand	Ward’s	470016-902	Special Sand-Gravel Mix and Stress Clay
Desktop Water Jet	Stratasys	OBJ-01400	Water jet system for post-processing of 3D prints
Epoxy	Gorilla Glue	4200102	GORILLA Epoxy Adhesive: Epoxy, 0.8 fl oz, Syringe, Clear, Thick Liquid
Fine Sand	Sandtastik	PLA25	Play Sand in Sparkling White
Gasket Material	McMaster-Carr	8525T65	Ethylene-propylene diene monomer (EPDM) 1/16” thickness
GrabCAD	Stratasys	GrabCAD	3D printer software
Magnets	K&J Magnetics	D64-N52	Neodymium Magnet Grade N52
SolidWorks 2021	Dassault Systèmes	SolidWorks 2021	CAD software
Sporosarcina pasteurii			Strain: ATCC 11859 / DSM 33
Vacuum Filtration cup 0.45µm	VWR	10040-450
Wire Mesh 1.5” Diameter Discs	McMaster-Carr	2812T43	Steel Wire Mesh Material