食管类器官的建立和组织学分析模拟从正常组织到癌性组织的进展

摘要

本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立和组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织到癌组织过渡期间细胞形态、空间组织和分子标志物表达模式的变化。

摘要

类器官已成为推进对肿瘤发生和癌症治疗理解的关键工具。通过生成代表不同肿瘤分期的人类类器官模型并进行组织学分析，可以更深入地了解随着肿瘤进展而细胞形态、空间结构和关键分子标志物表达的变化。本研究提出了一种建立和培养食管鳞状细胞类器官的综合方案。此外，该协议概述了利用固定、包埋和染色等技术评估类器官内关键分子的表达模式和空间组织的方法。通过该方案，确定了食管鳞状上皮细胞的空间结构和肿瘤发生过程中各种肿瘤生物标志物的表达的显着变化。该方案有助于类器官的构建和组织学分析，使研究人员能够研究上皮细胞在肿瘤发生和治疗干预的不同阶段的空间结构和分子改变。

引言

肿瘤发生是一个复杂的多阶段过程，其特征是细胞中进行性的分子和形态变化 ^1,2。食管鳞状细胞癌 （ESCC） 是一种普遍存在的恶性肿瘤，预后不良 ^3,4，通过四个不同的阶段体现了这种逐步进展：正常粘膜、低级别上皮内瘤变 （LGIN）、高级别上皮内瘤变 （HGIN） 和浸润性癌⁵。在这些阶段中，上皮细胞表现出分子表达模式和空间组织的动态变化，并伴有组织形态的系统性变化，从正常状态发展到恶性状态 ^6,7。尽管在理解 ESCC 发病机制方面取得了进展，但缺乏能够忠实地概括肿瘤进化的空间和时间方面的实验模型，同时能够进行系统的组织学和分子分析，这阻碍了对疾病进展和治疗开发的更深入机制理解。

虽然 2D 永生化癌细胞系对理解肿瘤发生做出了重大贡献，但它们在复制天然肿瘤的生物学复杂性和病理特征方面本身就受到限制⁸。动物模型虽然提供了体内背景，但由于物种特异性差异，通常无法预测人类的反应⁹。相比之下，类器官已成为一种变革性的临床前平台，它忠实地保留了人体组织的细胞异质性、结构和功能 10,11,12,13。作为临床前模型，类器官可以更好地捕捉原发性肿瘤的特征，从而能够详细研究肿瘤进展过程中的关键分子事件和细胞变化¹⁴。例如，Chen 等人利用来自 ESCC 不同阶段的患者来源的食管类器官来阐明上皮-成纤维细胞相互作用，最终验证了 ANXA1-FPR2 信号转导轴是 ESCC 发病机制的关键驱动因素⁶。同样，Ko 等人采用基因工程食管类器官来识别驱动 ESCC 启动和免疫逃避的关键遗传决定因素，展示了类器官模型如何有效地概括疾病特征并揭示新的治疗靶点¹⁵。

目前的方法通过建立可重复的方案来解决食管癌建模中的重要问题，该方案用于生成反映从正常上皮到浸润性癌的组织学进展的多阶段 ESCC 类器官。该系统使用 L-WRN 条件培养基整合了优化的培养条件，以保持上皮干性，并结合了组织学处理和多重免疫荧光 （mIF） 分析的标准化方案，为纵向分析肿瘤发生过程中的空间和分子变化提供了一个理想的平台。与 2D 培养等替代技术相比，该类器官平台独特地保留了组织结构，能够可视化空间组织的分子标志物，包括免疫检查点蛋白 PD-L1 （CD274），它通过抑制 T 细胞反应介导肿瘤免疫逃逸 16,17,18和增殖标志物 Ki-67。该方案使来自正常食管和癌前组织的类器官能够通过，帮助研究人员构建从正常组织到肿瘤的连续类器官模型¹⁹。通过对肿瘤发生过程中的空间和分子变化进行详细分析，该协议为研究人员提供了一个强大的工具，用于了解癌症发展和进展的潜在机制，从而有可能改进治疗策略。

该方法特别适用于研究 ESCC 和相关鳞状恶性肿瘤的上皮癌发生、肿瘤微环境相互作用或治疗反应的研究人员。其模块化设计允许适应研究其他分子标志物或信号通路，前提是纳入适当的验证步骤。通过提供标准化但灵活的平台，该协议旨在推进肿瘤生物学的临床前研究，并加速将机制见解转化为靶向治疗。

研究方案

本研究经中国医学科学院肿瘤医院机构评审委员会批准（批准号 20/069–2265、22/221-3423 和 23/305-4047）。2021 年至 2024 年期间，从中国医学科学院肿瘤医院接受手术或早期筛查食管鳞状细胞癌 （ESCC） 的患者身上获取食管组织样本，以建立人食管类器官。本研究纳入的患者均未在样本采集前接受化疗或放疗。获得所有参与者的知情同意，并从病历中检索相关临床信息。 材料表中提供了本研究中使用的试剂和设备的完整列表。

1. 食管上皮类器官的制备

1. L-WRN 条件培养基的制备
   1. L-WRN 细胞系的制备
      1. 在 37 °C 水浴中解冻 L-WRN 细胞系（在 -80 °C 下储存）1-2 分钟。与 5 mL 预热的基础培养基（补充有 10% FBS 的 DMEM）混合。
      2. 在室温 （RT） 下以 200 x g 离心混合物 5 分钟。
      3. 丢弃上清液。用 2-3 mL 新鲜预热的选择培养基（含有 10% FBS、0.5 mg/mL 潮霉素 B 和 0.5 mg/mL G-418 的 DMEM）重悬细胞。
         注意：将培养基保持在 4 °C（最长储存 1 个月）。
      4. 将细胞转移至含有选择培养基的 10 cm 培养皿中。在 37 °C 下在 5% CO₂ 加湿培养箱中培养细胞。
   2. L-WRN 细胞系的传代
      1. 使用 0.025% 胰蛋白酶-EDTA（在 37 °C 下 1-2 分钟）解离汇合细胞，并以 1：2 的比例分裂。
   3. L-WRN 条件培养基的收集
      1. 用 80% 细胞汇合度的基础培养基替换培养基。将上清液转移至离心管中。
      2. 通过 0.22 μm 膜过滤以消除细胞碎片。将滤液收集为 L-WRN 条件培养基。
         注意：将 L-WRN 条件培养基保持在 4 °C（1 周）或 -80 °C（6 个月）。
2. 人食管类器官培养基 （H-EOCM） 制备
   1. H-EOCM 制备
      1. 在 4 °C 下平衡 4 小时后涡旋 L-WRN 条件培养基（1.5 mL 体积）。
      2. 将高级 DMEM/F12 培养基与这些添加剂混合制成 H-EOCM：3% L-WRN 条件培养基、1× 抗、1× L-谷氨酰胺、1× N2 添加剂、1× B27 添加剂、0.15 mM HEPES、40 ng/mL EGF、10 μM Y-27632 和 50 μM A83-01。
         注意：将 H-EOCM 冷冻储存在 -20°C 下保存六个月。
3. 实验前准备
   1. 通过在 4 °C 下保持 4 小时来解冻 H-EOCM。

2. 建立人类食管类器官

1. 材料准备
   1. 在 4 °C 下解冻基底膜基质和 H-EOCM。 对手术剪刀和镊子进行消毒，以便进行下一次实验。
   2. 将移液器吸头预冷至 4 °C。 将 24 孔板预热至 37 °C。
2. 组织处理和细胞分离
   注：ESCC 肿瘤组织、异型增生病变（距肿瘤边缘 ≤2 cm）和匹配的正常食管组织（距肿瘤边缘 ≥5 cm）是从接受手术切除的同一 ESCC 个体中收集的。此外，正如我们之前的研究所述，通过 ESCC 早期检测和筛查计划获得多阶段食管样本 ^6,7。
   1. 在 5 mL 离心管中用室温洗涤缓冲液（含有 1×Anti-Anti 和 0.15 mM HEPES 的 PBS）清洁样品 3 次。
      注：将样品洗涤 3 次以上，以降低污染风险。
   2. 使用无菌剪刀将组织切成 1 mm³ 的碎片。将片段转移至 1.5 mL 离心管中。
   3. 用 1 mL 消化缓冲液悬浮样品，并在 37 °C、50-100 rpm 下摇动 10-20 分钟以消化组织。
   4. 将混合物在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液。
   5. 将沉淀重悬于 500 μL 的 0.025% 胰蛋白酶-EDTA 中。在 37 °C 下孵育 10 分钟。加入 1 mL 补充有 10% FBS 的 DMEM 以终止酶活性。
   6. 将悬浮液通过 70 μm 无菌过滤器。将滤液收集在 1.5 mL 离心管中。
   7. 将滤液在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液。用 100 μL H-EOCM 重悬细胞。
3. 类器官接种
   1. 测定细胞密度，然后制备新鲜的 1.5 mL 离心管，其中含有 5,000-15,000 个悬浮细胞。
   2. 在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 小心吸出上清液。将细胞均匀地重悬于 50-100 μL 基底膜基质中。
      注意：将基底膜基质储存在 4 °C 以避免凝固。
   3. 将 50 μL 基底膜基质和混合细胞添加到每个 24 孔板的中心。通过37°C孵育（持续时间30分钟）聚合基底膜基质。
   4. 加入 500 μL 预热的 H-EOCM （37 °C） 以覆盖基底膜基质。在 37 °C 的加湿 5% CO₂ 培养箱中培养类器官。
4. 介质更换
   1. 吸出用过的培养基并补充 500 μL 新鲜 H-EOCM（加热至 37 °C）。
      注意：每隔 3 天更换一次 H-EOCM。

3. 类器官的传代

1. 材料准备
   1. 在 4 °C 下解冻基底膜基质和 H-EOCM。 将移液器吸头预冷至 4 °C。 将 24 孔板预热至 37 °C。
2. 类器官的消化
   1. 轻轻去除 H-EOCM 培养基。在孔中加入 500 μL 预冷的传代缓冲液（高级 DMEM/F12，含有 1× 抗和0.15 mM HEPES，预冷至 4 °C）以熔化基底膜基质。
   2. 将基底膜基质与传代缓冲液混合在 1.5 mL 离心管中。用 500 μL 预冷的传代缓冲液洗涤孔，并收集缓冲液以检索任何剩余的类器官。
   3. 将缓冲液在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 轻轻吸出上清液。将 500 μL 重组胰蛋白酶加入试管中并孵育以进行酶消化（37 °C，15 分钟）。每隔 5 分钟重悬一次。
   4. 离心消化的样品（400 x g ，5 分钟，4 °C）。丢弃上清液。重复步骤 3.2.6 和 3.2.7。将细胞重悬于 100 μL H-EOCM 中。
3. 类器官接种
   1. 对于类器官接种，重复步骤 2.3。

4. 类器官冷冻和回收

1. 类器官冷冻
   1. 对于材料准备，请重复步骤 2.1。
   2. 对于类器官的消化，重复步骤 3.2。
   3. 类器官冷冻
      1. 测定细胞密度，然后制备含有 10,000 个悬浮细胞的新鲜 1.5 mL 离心管。
      2. 在 RT 下以 400 x g 离心样品 5 分钟。小心吸出上清液。
      3. 用 500-1000 μL 冻存培养基重悬细胞。转移到新的冻存管上。将冻存管在 -80 °C 下冷冻 24 小时。存档在液氮存储系统中，以便延长保存时间。
2. 冷冻类器官的解冻
   1. 对于材料的准备，请重复步骤 2.1。
   2. 冷冻类器官的解冻
      1. 在 37 °C 水浴中快速解冻冻冻管 2-3 分钟。将冷冻材料转移到 9 mL 预热的基础培养物 （37 °C） 中，并均匀重悬细胞。
      2. 将细胞悬液以 400 x g （在 RT 下）离心 5 分钟。小心吸出上清液。
   3. 类器官接种
      1. 要接种类器官，请重复步骤 2.3。

5. 类器官的组织学分析

1. 石蜡包埋切片的制备
   1. 材料准备
      1. 通过高压灭菌器在 250 mL 烧瓶中对 50 mL 包埋基质（水溶液：2% 琼脂 + 2.5% 明胶）进行灭菌。将 5 mL 分装到 15 mL 离心管中。在室温下储存。
   2. 类器官固定
      1. 重复步骤 3.2.1-3.2.2。在新鲜的 1.5 mL 试管中用 1 mL 传代缓冲液重悬沉淀物。
      2. 在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。去除上清液。将类器官重悬于 500 μL 的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中。在室温下孵育 1 小时或在 4 °C 下孵育至少 6 小时。
   3. 类器官包埋
      1. 离心混合物（400 x g ，5 分钟，RT）。去除上清液。在试管中加入 1 mL 传代缓冲液并重悬沉淀。
      2. 离心混合物（400 x g ，5 分钟，RT）。去除上清液。
      3. 将一根装有包埋剂 （5 mL） 的试管 （15 mL） 放入水浴（100 mL、150 mL 容器）中。以最大功率微波，直到水开始沸腾。
         注：微波加热前拧下 15 mL 试管的盖子。
      4. 在 1.5 mL 离心管中用 50 μL 包埋凝胶重悬类器官。将试管冷却至 4 °C，直到凝胶完全硬化。
      5. 将凝固的凝胶转移到 70% 乙醇中。储存在 4 °C。
   4. 石蜡块制备
      1. 通过乙醇系列（30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%）脱水凝胶，每次浓度 30 分钟。
      2. 将固化的凝胶放入透明的二甲苯中 30 分钟。将固化的凝胶浸入石蜡中，并使用加热的石蜡站包埋。
      3. 用切片机切下 4 μm 厚的切片。安装在载玻片上并在 65 °C 下干燥 1 小时。存放在干燥的环境中。
2. 类器官切片的免疫组织化学 （IHC） 染色
   1. 脱蜡和水合
      1. 在组织透明化剂中于 65 °C 加热切片 40 分钟。将载玻片在室温下浸入新鲜的组织透明化剂中 20 分钟。
      2. 通过含有乙醇系列的玻璃托盘处理载玻片：浸入 100% 乙醇中 10 分钟并重复一次，然后转移到 95% 乙醇中 5 分钟，然后用 85% 乙醇转移 5 分钟，然后 75% 乙醇 5 分钟，最后放入 4% PFA 中 10 分钟。
      3. 将无菌水加入耐热室中，并在摇床上以 80 rpm 的速度保持 5 分钟。重复此步骤两次。
   2. 抗原修复
      1. 将 Tris-EDTA 抗原 （pH 9.0） 修复溶液添加到热稳定室中以浸入载玻片。以最大强度（700 W，3 分钟）加热包含载玻片的热稳定室直至沸腾。将微波保持在低功率设置（70 W，15 分钟）并冷却至室温。
      2. 在振荡器上以 80 rpm 的转速在蒸馏水中洗涤 2 分钟。重复两次。用组织学笔圈出类器官的位置。
   3. 过氧化物酶封闭
      1. 滴加过氧化物酶封闭溶液以覆盖样品区域。在室温下在湿度室中孵育 20 分钟。
      2. 将玻片转移到热稳定室中。在 PBST（PBS + 0.1% 吐温 20）中以 80 rpm 洗涤 2 分钟。重复两次。
   4. 一抗孵育
      1. 轻轻擦去载玻片上多余的 PBST 液滴。
         注意：避免接触载玻片上的类器官。
      2. 滴加稀释的一抗以覆盖类器官区域。在室温下在湿度室中孵育 2 小时，或在 4 °C 下孵育 8-14 小时。 重复此步骤。
   5. 二抗孵育
      1. 重复步骤 5.2.4.1。滴加稀释的 HRP 二抗以覆盖类器官区域。在室温下在湿度室中孵育 20 分钟。重复此步骤。
   6. DAB（3,3′-二氨基联苯胺）染色
      1. 重复步骤 5.2.4.1。放置 1× DAB 以覆盖类器官区域。在室温下在湿度箱中孵育，直到颜色变成棕色。
      2. 将载玻片浸入蒸馏水中 5-10 秒以终止颜色变化。重复该步骤。
   7. 苏木精染色
      1. 在苏木精中染色 5-8 分钟。在 1% 酸性醇（1% HCl 在 70% 酒精中）中区分 5-10 秒。
      2. 将载玻片浸入蒸馏水中 5-10 秒。重复此步骤。
   8. 脱水
      1. 按顺序通过玻璃托盘处理载玻片：浸入 75% 乙醇中 5 分钟，转移至 85% 乙醇 5 分钟，移至 95% 乙醇中 5 分钟，然后在 100% 乙醇中单独浸泡两次，每次 10 分钟，最后放入二甲苯中连续两次 20 分钟。
   9. 滑动安装
      1. 将二甲苯添加到中性胶中，直到它变成透明。稍微风干。然后，滴入含有二甲苯的口香糖以覆盖类器官区域。
      2. 盖上盖玻片。扫描并分析幻灯片。
3. 多重免疫荧光 （mIF） 染色
   1. 对于脱蜡和水合，重复步骤 5.2.1。
   2. 对于过氧化物酶阻断，重复步骤 5.2.3。
   3. 对于抗原修复，重复步骤 5.2.3。
   4. 绵羊血清封闭。
      1. 重复步骤 5.2.4.1。添加绵羊血清封闭溶液以覆盖类器官区域。在室温下在湿度室中孵育 30 分钟。
      2. 在 PBST 中洗涤 2 分钟，重复两次。
   5. 对于一抗孵育，重复步骤 5.2.4。
   6. 对于二抗孵育，重复步骤 5.2.4.1。
      1. 滴加特异性二抗溶液以覆盖类器官区域。在室温下在湿度室中孵育 20 分钟。重复步骤 5.2.3.2。
         注意：从此步骤开始保护载玻片避光，直到实验结束。
   7. 荧光染料染色
      1. 重复步骤 5.3.4.1。滴加荧光染料溶液以覆盖类器官区域。
      2. 在室温下在湿度室中孵育 10-20 分钟。重复步骤 5.2.3.2。
   8. 对于多重染色，重复步骤 5.3.3-5.3.7。
   9. DAPI 染色
      1. 重复步骤 5.2.4.1。放置 DAPI 溶液以覆盖类器官区域。重复步骤 5.2.3.2。接下来，重复步骤 5.3.4.2。
      2. 将载玻片浸入无菌水中 2 分钟。
   10. 滑动安装
       1. 滴下抗淬灭封固剂以覆盖类器官区域。盖上盖玻片。
   11. 使用玻片扫描仪采集数字图像并对其进行分析。

结果

该方案描述了 ESCC 肿瘤发生不同阶段的类器官取样和组织学分析（图 1）。通过对 ESCC 患者的正常食管粘膜、低级别上皮内瘤变 （LGIN）、高级别上皮内瘤变 （HGIN） 和肿瘤组织进行采样，可以构建代表肿瘤发生不同阶段的类器官。此外，对这些类器官进行石蜡包埋和切片，然后进行免疫荧光染色。

为研究肿瘤发生过程中免疫抑...

讨论

类器官的建立和组织学分析代表了模拟肿瘤进展的重大进步。与研究肿瘤发生²⁰ 的现有方法相比，该方案具有显着优势。与传统的 2D 细胞培养系统不同，类器官保持了复杂的三维结构和细胞异质性，可以更好地反映体内条件。与动物模型相比，来自人体组织的类器官更准确地代表了人类疾病特征 ^9,21,22<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck	Cat#SLGPR33RB
24-well plate	Corning	Cat#3524
4% Paraformaldehyde	Beyotime	Cat# P0099
70 μm sterile strainer	Falcon	Cat#352350
A83-01	Tocris Bioscience	Cat# 2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	Cat# 12634028
Agar	Solarbio	Cat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)	Gibco	Cat# 15240062
B-27 supplement	Gibco	Cat# 17504044
CO2 incubator	Thermo	Cat#371GPCN
Collagenase IV	Gibco	Cat# 17104019
Cryostor	STEMCELL	Cat# 07930
DMEM	Corning	Cat# 10-013-CV
EGF	Gibco	Cat# PHG0313
Fetal bovine serum	Cell Technologies	Cat# 30070
G-418	Sigma	Cat# A1720
Gelatin	Solarbio	Cat# G8061
GlutaMAX	Gibco	Cat# 35050061
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	Cat# 354230
HE staining kit	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd	NA
HEPES	Gibco	Cat# 15630080
Histological pen	Zsbio	Cat#ZLI-9305
Hygromycin B	Sigma	Cat# 400050
Immunohistochemical staining kit	ZSGB-BIO	PV-8000
L-WRN	ATCC	CRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 supplement	Gibco	Cat# 17502048
Neutral gum	Zsbio	Cat#ZLI-9555
Opal 5-Color Manual IHC Kit	PANOVUE	Cat# 10144100100
PBS	MeilunBio	Cat#MA0015
Rabbit Monoclone anti-PD-L1	CST	Cat# 13684; RRID:AB_2687655
Rabbit Polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# ab16667; RRID:AB_302459
Rabbit Polyclonal anti-KRT6A	Proteintech	Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Sheep serum	Zsbio	Cat#ZLI-9056
TrypLE Express	Gibco	Cat# 12604021
TrypLE-EDTA	Gibco	Cat#15400-054
Whole slide image scanner	Hamamatsu	Cat#C13210
Y-27632	Selleck Chemicals	Cat# S1049