正常組織から癌組織への進行をモデル化する食道オルガノイドの樹立と組織学的解析

要約

本プロトコルは、腫瘍進行のさまざまな段階を表す食道オルガノイドモデルの確立と組織学的分析について説明しています。この方法により、研究者は、正常組織からがん組織への移行中の細胞形態、空間構成、および分子マーカー発現パターンの変化を研究することができます。

要約

オルガノイドは、腫瘍形成とがん治療の理解を深めるための極めて重要なツールとして浮上しています。さまざまな腫瘍の病期を表すヒトオルガノイドモデルを作成し、組織学的解析を行うことで、腫瘍の進行に伴う細胞形態の変化、空間構造、および主要な分子マーカーの発現についてより深く理解することができます。この研究は、食道扁平上皮細胞オルガノイドの確立と培養のための包括的なプロトコルを提示します。さらに、このプロトコルでは、オルガノイド内の重要な分子の発現パターンと空間構成を評価する方法を概説し、固定、埋め込み、染色などの技術を利用します。このプロトコルを通じて、食道扁平上皮細胞の空間構造と、腫瘍形成中のさまざまな腫瘍バイオマーカーの発現に有意な変化が同定されました。このプロトコルは、オルガノイドの構築と組織学的解析を容易にし、研究者が腫瘍形成と治療介入のさまざまな段階にわたる上皮細胞の空間構造と分子変化を調査することを可能にします。

概要

腫瘍形成は、細胞の進行性の分子的および形態学的変化を特徴とする複雑な多段階のプロセスです^1,2。予後不良の悪性腫瘍として蒔出される食道扁平上皮がん(ESCC)^3,4は、正常粘膜、低悪性度上皮内腫瘍(LGIN)、高悪性度上皮内腫瘍(HGIN)、浸潤がん⁵の4つの異なる段階を経て、この段階的な進行を例示しています。これらの段階を通じて、上皮細胞は分子発現パターンと空間構成にダイナミックな変化を示し、正常状態から悪性状態に進むにつれて組織形態の系統的な変化を伴います^6,7。ESCCの病因の理解が進んでいるにもかかわらず、腫瘍の進化の空間的および時間的側面を忠実に再現する実験モデルの欠如は、体系的な組織学的および分子的分析を可能にしながら、疾患の進行と治療法開発のより深いメカニズムの理解を妨げてきました。

2D不死化がん細胞株は、がん発生の理解に大きく貢献してきましたが、天然腫瘍の生物学的複雑さと病理学的特徴を再現するには本質的に限界があります⁸。動物モデルは、in vivoのコンテキストを提供しますが、種固有の違いにより、人間の応答を十分に予測できないことがよくあります⁹。対照的に、オルガノイドは、ヒト組織の細胞の不均一性、構造、および機能を忠実に保持する革新的な前臨床プラットフォームとして登場しました10,11,12,13。前臨床モデルとして、オルガノイドは原発腫瘍の特性をよりよく捉え、腫瘍の進行過程における主要な分子イベントと細胞変化の詳細な調査を可能にします¹⁴。例えば、Chenらは、ESCCのさまざまな段階の患者由来の食道オルガノイドを利用して、上皮-線維芽細胞の相互作用を解明し、最終的にANXA1-FPR2シグナル伝達軸がESCCの病因の重要なドライバーであることを検証しました⁶。同様に、Koらは、遺伝子操作された食道オルガノイドを使用して、ESCCの開始と免疫回避を促進する主要な遺伝的決定要因を特定し、オルガノイドモデルが疾患の特徴を効果的に再現し、新しい治療標的を明らかにする方法を示しました¹⁵。

本方法論は、正常な上皮から浸潤性がんへの組織学的進行を反映する多段階ESCCオルガノイドを生成するための再現性のあるプロトコルを確立することにより、食道がんモデリングにおける重要な問題を解決します。このシステムは、上皮幹細胞性を維持するためのL-WRNコンディショニング培地を使用して最適化された培養条件を統合し、組織学的処理およびマルチプレックス免疫蛍光(mIF)分析のための標準化されたプロトコルと組み合わせて、腫瘍形成中の空間的および分子的変化を縦断的に分析するための理想的なプラットフォームを提供します。2D培養などの代替技術と比較して、このオルガノイドプラットフォームは組織構造を独自に保存し、T細胞応答を阻害することにより腫瘍の免疫回避を媒介する免疫チェックポイントタンパク質PD-L1(CD274)を含む空間的に組織化された分子マーカーの可視化を可能にします16,17,18、キ67の拡散マーカー。このプロトコルにより、正常な食道組織および前がん組織からのオルガノイドの通過が可能になり、研究者が正常組織から腫瘍¹⁹までの連続オルガノイドモデルを構築するのに役立ちます。このプロトコルは、腫瘍形成中の空間的および分子的変化の詳細な分析を可能にすることにより、研究者にがんの発生と進行の根底にあるメカニズムを理解するための強力なツールを提供し、治療戦略の改善につながる可能性があります。

この方法論は、ESCCおよび関連する扁平上皮悪性腫瘍における上皮発がん、腫瘍微小環境相互作用、または治療応答を調査する研究者に特に適しています。そのモジュラー設計により、適切な検証手順が組み込まれていれば、他の分子マーカーやシグナル伝達経路の研究に適応できます。このプロトコルは、標準化されながらも柔軟なプラットフォームを提供することで、腫瘍生物学における前臨床研究を前進させ、メカニズムの洞察を標的療法に転換することを目指しています。

プロトコル

本研究は、中国医学院がん病院の治験審査委員会によって承認されました(承認番号20/069-2265、22/221-3423、23/305-4047)。食道組織サンプルは、ヒト食道オルガノイドの樹立を目的として、2021年から2024年にかけて中国医学院がん病院で食道扁平上皮がん(ESCC)の手術または早期スクリーニングを受けた患者から採取されました。この研究に含まれた患者は、サンプル収集前に化学療法または放射線療法を受けていませんでした。すべての参加者からインフォームドコンセントが得られ、関連する臨床情報が医療記録から取得されました。この研究で使用された試薬と機器の完全なリストは、 資料の表に記載されています。

1. 食道上皮オルガノイドの作製

1. L-WRNコンディショニング培地の調製
   1. L-WRN細胞株の調製
      1. L-WRN細胞株(-80°Cで保存)を37°Cの水浴で1〜2分間解凍します。5 mLの予熱した基礎培養培地(DMEMに10% FBSを添加)と混合します。
      2. 混合物を200 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。
      3. 上清を捨てます。2〜3 mLの新鮮な温めた選択培地(10% FBS、0.5 mg/mL ハイグロマイシンB、および0.5 mg/mL G-418を含むDMEM)で細胞を再懸濁します。
         注意: 培地は4°Cに保ちます(最大保管1か月)。
      4. 選択培地を入れた10cmの培養皿に細胞を移します。細胞を37°Cで5%_CO2 加湿インキュベーターで培養します。
   2. L-WRN細胞株の継代
      1. 0.025%トリプシン-EDTAを使用してコンフルエント細胞を解離し(37°Cで1〜2分)、1:2の比率で分割します。
   3. L-WRNコンディショニング培地のコレクション
      1. 培養液を80%の細胞コンフルエンスで基礎培養培地に置き換えます。上清を遠心分離管に移します。
      2. 0.22 μmのメンブレンをろ過して、細胞の破片を取り除きます。ろ液をL-WRNコンディショニング培地として収集します。
         注:L-WRNコンディショニング培地は4°C(1週間)または-80°C(6か月)に保管してください。
2. ヒト食道オルガノイド培地(H-EOCM)調製
   1. H-EOCMの準備
      1. L-WRNでコンディショニングした培地(容量1.5 mL)を、4°Cで4時間の平衡化後にボルテックスします。
      2. Advanced DMEM/F12培地をこれらの添加剤と組み合わせてH-EOCMを作成します:3% L-WRNコンディショニング培地、1× Anti-Anti、1× L-グルタミン、1× N2サプリメント、1× B27サプリメント、0.15 mM HEPES、40 ng/mL EGF、10 μM Y-27632、および50 μM A83-01。
         注:H-EOCMは-20°Cで冷凍保存し、6ヶ月間保存してください。
3. 実験前の準備
   1. H-EOCMを4°Cで4時間維持して解凍します。

2. ヒト食道オルガノイドの樹立

1. 材料の準備
   1. 基底膜マトリックスとH-EOCMを4°Cで解凍します。 次の実験のために手術用ハサミとピンセットを滅菌します。
   2. ピペットチップを4°Cに予冷します。 24ウェルプレートを37°Cに予温します。
2. 組織プロセッシングと細胞単離
   注:ESCC腫瘍組織、異形成病変(腫瘍縁から≤2 cm)、および一致する正常な食道組織(腫瘍縁から≥5 cm)は、外科的切除を受けたESCCの同じ個人から収集されました。さらに、これまでの研究^6,7で述べたように、ESCCの早期発見・スクリーニングプログラムを通じて多段階の食道サンプルが得られた。
   1. 5 mLの遠心分離チューブに室温の洗浄バッファー(1×Anti-Antiおよび0.15 mM HEPESを含むPBS)でサンプルを3回洗浄します。
      注:サンプルを3回以上洗浄して、汚染のリスクを減らします。
   2. 滅菌ハサミを使用して組織を1 mm³ つの断片にミンチにします。フラグメントを1.5 mL遠心チューブに移します。
   3. サンプルを1 mL消化バッファーで懸濁し、37°C、50〜100 rpmで10〜20分間振とうして組織を分解します。
   4. 混合物を400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。
   5. 沈殿物を0.025%トリプシン-EDTAの500μLに再懸濁します。37°Cで10分間インキュベートします。10% FBSを添加したDMEMを1 mL加えて、酵素活性を停止します。
   6. 懸濁液を70μmの滅菌フィルターに通します。ろ液を1.5mLの遠心分離チューブに集めます。
   7. 濾液を400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。細胞を100μLのH-EOCMで再懸濁します。
3. オルガノイド播種
   1. 細胞密度を決定し、5,000〜15,000個の細胞を懸濁液に入れた新鮮な1.5 mL遠心チューブを調製します。
   2. 400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重に吸引します。細胞を50-100 μLの基底膜マトリックスに均一に再懸濁します。
      注:固化を避けるために、基底膜マトリックスを4°Cで保管してください。
   3. 混合細胞を含む50 μLの基底膜マトリックスを各24ウェルプレートの中央に加えます。基底膜マトリックスを37°Cインキュベーション(30分間)で重合します。
   4. 予熱したH-EOCM(37°C)を500μL加えて、基底膜マトリックスを覆います。オルガノイドを加湿した5% CO₂ インキュベーターで37°Cで培養します。
4. ミディアム交換
   1. 使用済み培地を吸引し、500 μLの新鮮なH-EOCM(37°Cに加温)を補充します。
      注:H-EOCMは3日間隔で交換してください。

3. オルガノイドの継代

1. 材料の準備
   1. 基底膜マトリックスとH-EOCMを4°Cで解凍します。 ピペットチップを4°Cに予冷します。 24ウェルプレートを37°Cに予温します。
2. オルガノイドの消化
   1. H-EOCMミディアムを静かに取り出します。予冷した500 μLの通路バッファー(1× Anti-Antiと0.15 mM HEPESを含むAdvanced DMEM/F12、4°Cに予冷)をウェルに添加し、基底膜マトリックスを溶解します。
   2. 基底膜マトリックスとパッセージバッファーを1.5 mLの遠心チューブで組み合わせます。予冷した500 μLのパッセージバッファーでウェルを洗浄し、バッファーを回収して残りのオルガノイドを回収します。
   3. バッファーを400 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清をやさしく吸引します。500 μLの組換えトリプシンをチューブに加え、酵素消化(37°C、15分)のためにインキュベートします。5分間隔で再懸濁します。
   4. 分解したサンプルを遠心分離します(400 x g、5分間、4°C)。上清を捨てます。手順 3.2.6 と 3.2.7 を繰り返します。細胞を100μLのH-EOCMに再懸濁します。
3. オルガノイド播種
   1. オルガノイド播種の場合は、手順2.3を繰り返します。

4. オルガノイドの凍結と回復

1. オルガノイド凍結
   1. 材料の準備については、手順2.1を繰り返します。
   2. オルガノイドの消化には、手順3.2を繰り返します。
   3. オルガノイド凍結
      1. 細胞密度を測定し、10,000個の細胞を懸濁液に入れた新鮮な1.5 mL遠心チューブを調製します。
      2. サンプルを400 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を慎重に吸引します。
      3. 細胞を500〜1000μLの凍結保存培地で再懸濁します。新しいクライオチューブに移します。クライオチューブを-80°Cで24時間凍結します。液体窒素貯蔵システムに保存して、長期保存します。
2. 凍結オルガノイドの解凍
   1. 材料の準備については、手順2.1を繰り返します。
   2. 凍結オルガノイドの解凍
      1. クライオチューブを37°Cのウォーターバスで2〜3分間急速に解凍します。凍結した材料を9 mLの予熱した基礎培養物(37 °C)に移し、細胞を均一に再懸濁します。
      2. 細胞懸濁液を400 x g (室温)で5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引します。
   3. オルガノイド播種
      1. オルガノイドの播種については、手順2.3を繰り返します。

5. オルガノイドの組織学的解析

1. パラフィン包埋切片の調製
   1. 材料の準備
      1. 50 mLの包埋マトリックス(水溶液:2%寒天+2.5%ゼラチン)を250 mLフラスコにオートクレーブ で 滅菌します。5 mLを15 mLの遠心チューブに分注します。室温で保存してください。
   2. オルガノイド固定
      1. 手順3.2.1〜3.2.2を繰り返します。沈殿物を1 mLの通過バッファーと共に、新鮮な1.5 mLチューブに再懸濁します。
      2. 400 x g 、4°C、5分間遠心分離します。上清を取り除きます。オルガノイドを500 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)に再懸濁します。室温で1時間、または4°Cで6時間以上インキュベートします。
   3. オルガノイドの埋め込み
      1. 混合物を遠心分離します(400 x g、5分、RT)。上清を取り除きます。チューブに1 mLの通過バッファーを加え、沈殿物を再懸濁します。
      2. 混合物を遠心分離します(400 x g、5分、RT)。上清を取り除きます。
      3. 1本のチューブ(15 mL)を埋め込み培地(5 mL)とともにウォーターバス(100 mL、150 mL容器)に入れます。水が沸騰し始めるまで、最大出力で電子レンジを加熱します。
         注意: 電子レンジで加熱する前に、15mLチューブのキャップを緩めてください。
      4. オルガノイドを50 μLの包埋ゲルで1.5 mLの遠心チューブに再懸濁します。ゲルが完全に固まるまでチューブを4°Cに冷却します。
      5. 固化したゲルを70%エタノールに移します。4°Cで保存してください。
   4. パラフィンブロック調製
      1. エタノールシリーズ(30%→50%→70%→80%→95%→100%)でゲルを脱水します。
      2. 固化したゲルを透明なキシレンに30分間入れます。固化したゲルをパラフィンに浸し、加熱したパラフィンステーションを使用して埋め込みます。
      3. 厚さ4μmのスライスをミクロトームでカットします。スライドに取り付け、65°Cで1時間乾燥させます。乾燥した状態で保管してください。
2. オルガノイドスライスの免疫組織化学染色(IHC)染色
   1. 脱ロウと水分補給
      1. スライスを組織清澄剤で65°Cで40分間加熱します。スライドを新鮮な組織透明剤に室温で20分間浸します。
      2. エタノールシリーズを含むガラストレイを通してスライドを処理します:100%エタノールに10分間浸し、一度繰り返し、次に95%エタノールに5分間、続いて85%エタノールを5分間、次に75%エタノールを5分間、最後に4%PFAに10分間入れます。
      3. 滅菌水を耐熱性チャンバーに加え、シェーカーで5rpmで80分間保ちます。この手順を 2 回繰り返します。
   2. 抗原賦活化
      1. Tris-EDTA抗原(pH 9.0)賦活化溶液を耐熱性チャンバーに添加し、スライドを浸漬します。スライドを含む耐熱性チャンバーを最大強度(700 W、3分)で沸騰するまで電子レンジで加熱します。電子レンジは低電力設定(70 W、15分)に保ち、室温まで冷却します。
      2. 蒸留水で80rpmのシェーカーで2分間洗浄します。2回繰り返します。オルガノイドの位置を組織学的ペンで丸で囲みます。
   3. ペルオキシダーゼブロッキング
      1. ペルオキシダーゼブロッキング溶液を滴下して、サンプル領域をカバーします。湿度チャンバー内で室温で20分間インキュベートします。
      2. スライドを耐熱性チャンバーに移します。PBST(PBS + 0.1% Tween 20)で80 rpmで2分間洗浄します。2回繰り返します。
   4. 一次抗体のインキュベーション
      1. スライド上の余分なPBST液滴をやさしく拭き取ります。
         注:スライド上のオルガノイドには触れないでください。
      2. 希釈した一次抗体をオルガノイド領域を覆うように滴下します。湿度チャンバー内で室温で2時間、または4°Cで8〜14時間インキュベートします。 この手順を繰り返します。
   5. 二次抗体インキュベーション
      1. 手順 5.2.4.1 を繰り返します。希釈したHRP二次抗体を滴下して、オルガノイド領域を覆います。湿度チャンバー内で室温で20分間インキュベートします。この手順を繰り返します。
   6. DAB(3,3′-ジアミノベンジジン)染色
      1. 手順 5.2.4.1 を繰り返します。オルガノイド領域をカバーするために1×DABをドロップします。色が茶色に変わるまで、室温の湿度チャンバーでインキュベートします。
      2. スライドを蒸留水に5〜10秒間浸して、色の変化を終了します。この手順を繰り返します。
   7. ヘマトキシリン染色
      1. ヘマトキシリンで5〜8分間染色します。1%酸性アルコール(70%アルコール中1%HCl)で5〜10秒間分化します。
      2. スライドを蒸留水に5〜10秒間浸します。この手順を繰り返します。
   8. 脱水
      1. スライドをガラストレイに順番に処理します:75%エタノールに5分間浸漬し、85%エタノールに5分間移し、95%エタノールに5分間移動し、続いて100%エタノールにそれぞれ10分間2回別々に浸漬し、最後にキシレンに2回連続して20分間置きます。
   9. スライド取付
      1. 中性ガムにキシレンを透明になるまで加えます。少し風乾します。次に、ガムをキシレンで滴下してオルガノイド領域を覆います。
      2. カバースリップを塗ります。スライドをスキャンして分析します。
3. マルチプレックス免疫蛍光染色(mIF)染色
   1. 脱ロウと水分補給については、手順5.2.1を繰り返します。
   2. ペルオキシダーゼブロッキングの場合は、手順5.2.3を繰り返します。
   3. 抗原賦活化については、ステップ5.2.3を繰り返します。
   4. 羊の血清ブロッキング。
      1. 手順 5.2.4.1 を繰り返します。オルガノイド領域を覆うように羊の血清遮断溶液を追加します。湿度チャンバー内で室温で30分間インキュベートします。
      2. PBSTで2分間洗浄し、2回繰り返します。
   5. 一次抗体のインキュベーションについては、ステップ5.2.4を繰り返します。
   6. 二次抗体のインキュベーションについては、ステップ5.2.4.1を繰り返します。
      1. オルガノイド領域を覆うように特異的な二次抗体溶液を滴下します。湿度チャンバー内で室温で20分間インキュベートします。手順 5.2.3.2 を繰り返します。
         注:このステップから実験終了まで、スライドを光から保護します。
   7. 蛍光色素染色
      1. 手順5.3.4.1を繰り返します。蛍光色素溶液を滴下してオルガノイド領域を覆います。
      2. 湿度チャンバー内で室温で10〜20分間インキュベートします。手順 5.2.3.2 を繰り返します。
   8. マルチ染色の場合は、手順5.3.3-5.3.7を繰り返します。
   9. DAPI染色
      1. 手順 5.2.4.1 を繰り返します。オルガノイド領域を覆うようにDAPI溶液を滴下します。手順 5.2.3.2 を繰り返します。次に、手順5.3.4.2を繰り返します。
      2. スライドを滅菌水に2分間浸します。
   10. スライド取付
       1. オルガノイド領域を覆うように退色防止用封入剤を落とします。カバースリップを塗ります。
   11. スライドスキャナーでデジタル画像を取得し、解析します。

結果

このプロトコルでは、ESCC腫瘍形成のさまざまな段階でのオルガノイドサンプリングと組織学的分析について説明します(図1)。ESCC患者から正常な食道粘膜、低悪性度上皮内腫瘍(LGIN)、高悪性度上皮内腫瘍(HGIN)、および腫瘍組織をサンプリングすることにより、腫瘍形成のさまざまな段階を表すオルガノイドを構築できます。さらに、これらのオ?...

ディスカッション

オルガノイドの確立と組織学的解析は、腫瘍進行のモデリングにおける大きな進歩を表しています。このプロトコルは、腫瘍形成を研究するための既存の方法よりも顕著な利点を提供します²⁰。従来の2D細胞培養システムとは異なり、オルガノイドは複雑な3次元構造と細胞の不均一性を維持し、in vivo条件をよりよく反映します。動物モデルと...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck	Cat#SLGPR33RB
24-well plate	Corning	Cat#3524
4% Paraformaldehyde	Beyotime	Cat# P0099
70 μm sterile strainer	Falcon	Cat#352350
A83-01	Tocris Bioscience	Cat# 2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	Cat# 12634028
Agar	Solarbio	Cat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)	Gibco	Cat# 15240062
B-27 supplement	Gibco	Cat# 17504044
CO2 incubator	Thermo	Cat#371GPCN
Collagenase IV	Gibco	Cat# 17104019
Cryostor	STEMCELL	Cat# 07930
DMEM	Corning	Cat# 10-013-CV
EGF	Gibco	Cat# PHG0313
Fetal bovine serum	Cell Technologies	Cat# 30070
G-418	Sigma	Cat# A1720
Gelatin	Solarbio	Cat# G8061
GlutaMAX	Gibco	Cat# 35050061
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	Cat# 354230
HE staining kit	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd	NA
HEPES	Gibco	Cat# 15630080
Histological pen	Zsbio	Cat#ZLI-9305
Hygromycin B	Sigma	Cat# 400050
Immunohistochemical staining kit	ZSGB-BIO	PV-8000
L-WRN	ATCC	CRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 supplement	Gibco	Cat# 17502048
Neutral gum	Zsbio	Cat#ZLI-9555
Opal 5-Color Manual IHC Kit	PANOVUE	Cat# 10144100100
PBS	MeilunBio	Cat#MA0015
Rabbit Monoclone anti-PD-L1	CST	Cat# 13684; RRID:AB_2687655
Rabbit Polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# ab16667; RRID:AB_302459
Rabbit Polyclonal anti-KRT6A	Proteintech	Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Sheep serum	Zsbio	Cat#ZLI-9056
TrypLE Express	Gibco	Cat# 12604021
TrypLE-EDTA	Gibco	Cat#15400-054
Whole slide image scanner	Hamamatsu	Cat#C13210
Y-27632	Selleck Chemicals	Cat# S1049