Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi

Özet

Bu protokol, tümör ilerlemesinin farklı aşamalarını temsil eden özofagus organoid modellerinin oluşturulmasını ve histolojik analizini açıklamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların normalden kanserli dokulara geçiş sırasında hücresel morfoloji, mekansal organizasyon ve moleküler belirteç ekspresyon modellerindeki değişiklikleri incelemelerini sağlar.

Özet

Organoidler, tümör oluşumu ve kanser tedavisinin anlaşılmasını ilerletmek için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Farklı tümör evrelerini temsil eden insan organoid modelleri üreterek ve histolojik analizler yaparak, tümör ilerledikçe hücresel morfoloji, mekansal mimari ve temel moleküler belirteçlerin ekspresyonundaki değişiklikler hakkında daha derin bir anlayış elde etmek mümkündür. Bu çalışma, özofagus skuamöz hücre organoidlerinin oluşturulması ve kültürü için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Ek olarak, protokol, fiksasyon, gömme ve boyama gibi teknikleri kullanarak, organoidler içindeki kritik moleküllerin ekspresyon modellerini ve uzamsal organizasyonunu değerlendirmek için yöntemleri ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol sayesinde, özofagus skuamöz epitel hücrelerinin mekansal yapısında ve tümör oluşumu sırasında çeşitli tümör biyobelirteçlerinin ekspresyonunda önemli değişiklikler tespit edilmiştir. Protokol, organoidlerin yapımını ve histolojik analizini kolaylaştırarak, araştırmacıların tümör oluşumu ve terapötik müdahalenin farklı aşamalarında epitel hücrelerinin mekansal mimarisini ve moleküler değişikliklerini araştırmalarını sağlar.

Giriş

Tümör oluşumu, hücrelerde ilerleyici moleküler ve morfolojik değişiklikler ile karakterize karmaşık, çok aşamalı bir süreçtir ^1,2. Kötü prognoz ^3,4 ile yaygın bir malignite olan özofagus skuamöz hücreli karsinom (ESCC), bu aşamalı ilerlemeyi dört farklı aşamada örneklemektedir: normal mukoza, düşük dereceli intraepitelyal neoplazi (LGIN), yüksek dereceli intraepitelyal neoplazi (HGIN) ve invaziv karsinom⁵. Bu aşamalar boyunca, epitel hücreleri, normal bir durumdan malign bir duruma ilerlerken doku morfolojisinde sistematik değişikliklerin eşlik ettiği moleküler ekspresyon modellerinde ve uzamsal organizasyonda dinamik değişiklikler sergiler ^6,7. ESCC patogenezinin anlaşılmasındaki ilerlemelere rağmen, tümör evriminin mekansal ve zamansal yönlerini sadık bir şekilde özetleyen deneysel modellerin eksikliği - sistematik histolojik ve moleküler analizlere olanak sağlarken - hastalığın ilerlemesi ve terapötik gelişimin daha derin mekanik anlayışını engellemiştir.

2D ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatları, onkogenezin anlaşılmasına önemli katkılarda bulunmuş olsa da, doğal tümörlerin biyolojik karmaşıklığını ve patolojik özelliklerini çoğaltmada doğal olarak sınırlıdır⁸. Hayvan modelleri, in vivo bağlam sağlasa da, türe özgü farklılıklar nedeniyle insan tepkilerini genellikle zayıf bir şekilde tahmin eder⁹. Buna karşılık, organoidler, insan dokularının hücresel heterojenliğini, mimarisini ve işlevselliğini sadık bir şekilde koruyan dönüştürücü bir klinik öncesi platform olarak ortaya çıkmıştır 10,11,12,13. Klinik öncesi modeller olarak, organoidler primer tümörlerin özelliklerini daha iyi yakalar ve tümör ilerlemesi sırasında önemli moleküler olayların ve hücresel değişikliklerin ayrıntılı olarak araştırılmasını sağlar¹⁴. Örneğin, Chen ve ark. epitelyal-fibroblast etkileşimlerini aydınlatmak için ESCC'nin farklı aşamalarından hasta kaynaklı özofagus organoidlerini kullandı ve sonuçta ANXA1-FPR2 sinyal eksenini ESCC patogenezi^6'nın kritik bir itici gücü olarak doğruladı. Benzer şekilde, Ko ve ark. ESCC başlangıcını ve immün kaçışı yönlendiren temel genetik belirleyicileri tanımlamak için genetik olarak tasarlanmış özofagus organoidleri kullandılar ve organoid modellerin hastalık özelliklerini nasıl etkili bir şekilde özetleyebileceğini ve yeni terapötik hedefleri nasıl ortaya çıkarabileceğini gösterdi¹⁵.

Mevcut metodoloji, normal epitelden invaziv karsinomlara kadar histolojik ilerlemeyi yansıtan çok aşamalı ESCC organoidleri oluşturmak için tekrarlanabilir bir protokol oluşturarak özofagus kanseri modellemesindeki önemli sorunları çözmektedir. Bu sistem, histolojik işleme ve multipleks immünofloresan (mIF) analizi için standartlaştırılmış protokollerle birlikte epitel sapını korumak için L-WRN koşullandırılmış bir ortam kullanarak optimize edilmiş kültür koşullarını entegre eder ve tümör oluşumu sırasında uzamsal ve moleküler değişiklikleri uzunlamasına analiz etmek için ideal bir platform sağlar. 2D kültürler gibi alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, bu organoid platform, doku mimarisini benzersiz bir şekilde koruyarak, T hücresi yanıtlarını inhibe ederek tümör bağışıklık kaçışına aracılık eden bağışıklık kontrol noktası proteini PD-L1 (CD274) dahil olmak üzere uzamsal olarak organize edilmiş moleküler belirteçlerin görselleştirilmesini sağlar ^16,17,18ve çoğalma belirteci Ki-67. Protokol, normal özofagus ve prekanseröz doku geçişinden organoidleri mümkün kılarak, araştırmacıların normal dokudan tümör^19'a kadar sürekli bir organoid model oluşturmasına yardımcı olur. Bu protokol, tümör oluşumu sırasındaki mekansal ve moleküler değişikliklerin ayrıntılı analizini sağlayarak, araştırmacılara kanser gelişimi ve ilerlemesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için güçlü bir araç sunar ve potansiyel olarak gelişmiş terapötik stratejilere yol açar.

Bu metodoloji özellikle ESCC ve ilgili skuamöz malignitelerde epitelyal karsinogenez, tümör mikroçevre etkileşimleri veya terapötik yanıtları araştıran araştırmacılar için uygundur. Modüler tasarımı, uygun doğrulama adımlarının dahil edilmesi koşuluyla, diğer moleküler belirteçleri veya sinyal yollarını incelemek için adaptasyona izin verir. Bu protokol, standartlaştırılmış ancak esnek bir platform sunarak, tümör biyolojisinde klinik öncesi araştırmaları ilerletmeyi ve mekanik içgörülerin hedefe yönelik tedavilere dönüştürülmesini hızlandırmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Bu çalışma, Çin Tıp Bilimleri Akademisi Kanser Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 20/069–2265, 22/221-3423 ve 23/305-4047). Özofagus doku örnekleri, insan özofagus organoidlerinin oluşturulması amacıyla 2021 ve 2024 yılları arasında Çin Tıp Bilimleri Akademisi Kanser Hastanesinde özofagus skuamöz hücreli karsinomu (ESCC) için ameliyat veya erken tarama yapılan hastalardan elde edildi. Bu çalışmaya dahil edilen hastaların hiçbiri örnek toplanmadan önce kemoterapi veya radyoterapi almamıştı. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı ve ilgili klinik bilgiler tıbbi kayıtlardan alındı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların tam listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Özofagus epitelyal organoidlerinin hazırlanması

1. L-WRN şartlandırılmış ortamın hazırlanması
   1. L-WRN hücre hattının hazırlanması
      1. L-WRN hücre hattını (-80 °C'de saklayın) 37 ° C'lik bir su banyosunda 1-2 dakika çözün. 5 mL önceden ısıtılmış bazal kültür ortamı ile karıştırın (% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM).
      2. Karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
      3. Süpernatanı atın. Hücreleri 2-3 mL taze önceden ısıtılmış seçim ortamı (% 10 FBS, 0.5 mg / mL higromisin B ve 0.5 mg / mL G-418 içeren DMEM) ile yeniden süspanse edin.
         NOT: Ortamı 4 °C'de tutun (maksimum saklama 1 ay).
      4. Hücreleri, seçim ortamını içeren 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde kültürleyin.
   2. L-WRN hücre hattının geçişi
      1. % 0.025 tripsin-EDTA (37 ° C'de 1-2 dakika) kullanarak birleşen hücreleri ayırın ve 1: 2 oranında bölün.
   3. L-WRN şartlandırılmış ortamın toplanması
      1. Kültür ortamını% 80 hücre birleşiminde bazal kültür ortamı ile değiştirin. Süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın.
      2. Hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için 0,22 μm membrandan süzün. Süzüntüyü L-WRN ile koşullandırılmış bir ortam olarak toplayın.
         NOT: L-WRN şartlandırılmış ortamı 4 ° C'de (1 hafta) veya -80 ° C'de (6 ay) tutun.
2. İnsan özofagus organoid kültür ortamı (H-EOCM) hazırlığı
   1. H-EOCM hazırlığı
      1. 4 ° C'de 4 saatlik dengelemenin ardından L-WRN ile koşullandırılmış ortamı (1.5 mL hacim) vorteksleyin.
      2. H-EOCM oluşturmak için Gelişmiş DMEM / F12 ortamını bu katkı maddeleriyle birleştirin:% 3 L-WRN koşullu ortam, 1× Anti-Anti, 1× L-glutamin, 1× N2 takviyesi, 1× B27 takviyesi, 0.15 mM HEPES, 40 ng / mL EGF, 10 μM Y-27632 ve 50 μM A83-01.
         NOT: Altı aylık koruma için H-EOCM'nin donmuş muhafazasını -20 ° C'de tutun.
3. Deney öncesi hazırlık
   1. H-EOCM'yi 4 saat boyunca 4 ° C'de tutarak çözdürün.

2. İnsan özofagus organoidinin kurulması

1. Malzemelerin hazırlanması
   1. Bazal membran matrisini ve H-EOCM'yi 4 °C'de çözün. Bir sonraki deney için cerrahi makas ve cımbızı sterilize edin.
   2. Pipet uçlarını 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 24 oyuklu plakayı 37 °C'ye önceden ısıtın.
2. Doku işleme ve hücre izolasyonu
   NOT: ESCC tümör dokusu, displastik lezyonlar (tümör kenarından ≤2 cm) ve uyumlu normal özofagus dokusu (tümör kenarından ≥5 cm) cerrahi rezeksiyon yapılan ESCC'li aynı bireylerden toplandı. Ek olarak, önceki çalışmalarımızda anlatıldığı gibi bir ESCC erken tespit ve tarama programı aracılığıyla çok aşamalı özofagus örnekleri elde edildi ^6,7.
   1. Numuneyi oda sıcaklığında yıkama tamponu ile 5 mL santrifüj tüplerinde ×Anti-Anti ve 0.15 mM HEPES içeren PBS) üç kez temizleyin.
      NOT: Kontaminasyon riskini azaltmak için numuneleri üç defadan fazla yıkayın.
   2. Steril makas kullanarak dokuyu 1 mm³ parçaya doğrayın. Parçaları 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
   3. Numuneyi 1 mL sindirim tamponu ile askıya alın ve dokuyu sindirmek için 37 ° C, 50-100 rpm'de 10-20 dakika çalkalayın.
   4. Karışımı 400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   5. Çökeltiyi 500 μL% 0.025 tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Enzimatik aktiviteyi durdurmak için% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL DMEM ekleyin.
   6. Süspansiyonu 70 μm steril bir filtreden geçirin. Süzüntüyü 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
   7. 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj filtratı. Süpernatanı atın. Hücreleri 100 μL H-EOCM ile yeniden süspanse edin.
3. Organoid tohumlama
   1. Hücre yoğunluğunu belirleyin, ardından süspansiyonda 5.000-15.000 hücre içeren 1.5 mL'lik taze bir santrifüj tüpü hazırlayın.
   2. 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin. 50-100 μL bazal membran matrisindeki hücreleri eşit şekilde nazikçe yeniden süspanse edin.
      NOT: Katılaşmayı önlemek için bazal membran matrisini 4 °C'de saklayın.
   3. Her 24 oyuklu plakanın merkezine karışık hücrelerle birlikte 50 μL bazal membran matrisi ekleyin. Bazal membran matrisini 37 °C inkübasyon (30 dakika süre) ile polimerize edin.
   4. Bazal membran matrisini kaplamak için 500 μL önceden ısıtılmış H-EOCM (37 °C) ekleyin. Organoidleri 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde kültürleyin.
4. Orta değiştirme
   1. Harcanan ortamı aspire edin ve 500 μL taze H-EOCM (37 °C'ye ısıtılmış) ile doldurun.
      NOT: H-EOCM'yi 3 günlük aralıklarla değiştirin.

3. Organoidlerin pasajı

1. Malzemelerin hazırlanması
   1. Bazal membran matrisini ve H-EOCM'yi 4 °C'de çözün. Pipet uçlarını 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 24 oyuklu plakayı 37 °C'ye önceden ısıtın.
2. Organoidin sindirimi
   1. H-EOCM ortamını nazikçe çıkarın. Bazal membran matrisini eritmek için kuyuya 500 μL önceden soğutulmuş geçiş tamponu (1× Anti-Anti ve 0,15 mM HEPES içeren Gelişmiş DMEM/F12, 4 °C'ye önceden soğutulmuş) ekleyin.
   2. Bazal membran matrisini 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde geçiş tamponu ile birleştirin. Kuyuyu 500 μL önceden soğutulmuş geçiş tamponu ile yıkayın ve kalan organoidleri almak için tamponu toplayın.
   3. Tamponu 4 ° C'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe aspire edin. Tüpe 500 μL rekombinant tripsin ekleyin ve enzimatik sindirim için inkübe edin (37 °C, 15 dakika). 5 dakikalık aralıklarla yeniden askıya alın.
   4. Sindirilmiş numuneyi santrifüjleyin (400 x g, 5 dk, 4 °C). Süpernatanı atın. 3.2.6 ve 3.2.7 adımlarını tekrarlayın. Hücreleri 100 μL H-EOCM'de yeniden süspanse edin.
3. Organoid tohumlama
   1. Organoid tohumlama için adım 2.3'ü tekrarlayın.

4. Organoid dondurma ve geri kazanım

1. Organoid dondurma
   1. Malzemelerin hazırlanması için adım 2.1'i tekrarlayın.
   2. Organoidlerin sindirimi için adım 3.2'yi tekrarlayın.
   3. Organoid dondurma
      1. Hücre yoğunluğunu belirleyin, ardından süspansiyonda 10.000 hücre bulunan 1,5 mL'lik yeni bir santrifüj tüpü hazırlayın.
      2. Numuneleri RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
      3. Hücreleri 500-1000 μL kriyoprezervasyon ortamı ile yeniden süspanse edin. Yeni bir kriyotüpe aktarın. Kriyotüpü -80 °C'de 24 saat dondurun. Uzun süreli koruma için sıvı nitrojen depolama sisteminde arşivleyin.
2. Donma organoidinin çözülmesi
   1. Malzemelerin hazırlanması için 2.1 adımını tekrarlayın.
   2. Donma organoidinin çözülmesi
      1. Kriyotüpü 37 °C'lik bir su banyosunda 2-3 dakika hızla çözdürün. Donmuş materyali 9 mL önceden ısıtılmış bazal kültüre (37 °C) aktarın ve hücreleri eşit şekilde yeniden süspanse edin.
      2. Hücre süspansiyonunu 400 x g'da (RT'de) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
   3. Organoid tohumlama
      1. Organoidleri tohumlamak için adım 2.3'ü tekrarlayın.

5. Organoidin histolojik analizi

1. Parafine gömülü bölümlerin hazırlanması
   1. Malzemelerin hazırlanması
      1. 50 mL gömme matrisini (sulu çözelti: %2 agar + %2.5 jelatin) otoklav ile 250 mL'lik bir şişede sterilize edin. 5 mL'yi 15 mL'lik santrifüj tüplerine ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
   2. Organoid sabitleme
      1. 3.2.1-3.2.2 adımlarını tekrarlayın. Çökeltiyi 1.5 mL'lik taze bir tüpte 1 mL geçiş tamponu ile yeniden süspanse edin.
      2. 400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Organoidleri 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de en az 6 saat inkübe edin.
   3. Organoid gömme
      1. Karışımı santrifüjleyin (400 x g, 5 dk, RT). Süpernatanı çıkarın. Tüpe 1 mL geçiş tamponu ekleyin ve çökeltmeyi yeniden askıya alın.
      2. Karışımı santrifüjleyin (400 x g, 5 dk, RT). Süpernatanı çıkarın.
      3. Gömme ortamı (5 mL) olan bir tüpü (15 mL) su banyosuna (100 mL, 150 mL kap) yerleştirin. Su kaynamaya başlayana kadar maksimum güçte mikrodalga.
         NOT: Mikrodalgada pişirmeden önce 15 mL'lik tüpün kapağını sökün.
      4. Organoidleri 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 μL gömme jeli ile yeniden süspanse edin. Jel tamamen sertleşene kadar tüpü 4 °C'ye soğutun.
      5. Katılaşmış jeli% 70 etanole aktarın. 4 °C'de saklayın.
   4. Parafin blok hazırlama
      1. Jeli etanol serisinden (%30 → %50 → %70 → %80 → %95 → %100) ile konsantrasyon başına 30 dakika kurutun.
      2. Katılaşmış jeli 30 dakika boyunca berrak ksilenin içine koyun. Katılaşmış jeli parafine batırın ve ısıtılmış bir parafin istasyonu kullanarak gömün.
      3. Bir mikrotom ile 4 μm kalınlığında dilimler kesin. Slaytlara monte edin ve 65 °C'de 1 saat kurutun. Kuru koşullarda saklayın.
2. Organoid dilimlerin immünohistokimya (IHC) boyanması
   1. Mum alma ve hidrasyon
      1. Dilimleri doku temizleme maddesinde 65 °C'de 40 dakika ısıtın. Slaytı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca taze doku temizleme maddesine daldırın.
      2. Slaytları etanol serisi içeren cam tepsilerden işleyin: 10 dakika boyunca %100 etanole daldırın ve bir kez tekrarlayın, ardından 5 dakika boyunca %95 etanole, ardından 5 dakika boyunca %85 etanole, ardından 5 dakika boyunca %75 etanole aktarın ve son olarak 10 dakika boyunca %4 PFA'ya yerleştirin.
      3. Termostabil hazneye sterilize su ekleyin ve çalkalayıcıda 80 rpm'de 5 dakika tutun. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
   2. Antijen alımı
      1. Slaytları daldırmak için termostabil hazneye Tris-EDTA antijen (pH 9.0) alma solüsyonu ekleyin. Slaytları içeren termostabil odayı kaynayana kadar maksimum yoğunlukta (700 W, 3 dakika) mikrodalgada ısıtın. Mikrodalgayı düşük güç ayarında (70 W, 15 dakika) tutun ve oda sıcaklığına soğutun.
      2. Damıtılmış suda 2 dakika boyunca 80 rpm'de bir çalkalayıcıda yıkayın. İki kez tekrarlayın. Organoidlerin yerini histolojik bir kalemle daire içine alın.
   3. Peroksidaz blokajı
      1. Numune alanını kaplamak için peroksidaz bloke edici solüsyonu bırakın. Oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin.
      2. Slaytları termostabil bir odaya aktarın. PBST'de (PBS + %0.1 Tween 20) 80 rpm'de 2 dakika yıkayın. İki kez tekrarlayın.
   4. Birincil antikor inkübasyonu
      1. Slaytlardaki fazla PBST damlacıklarını nazikçe silin.
         NOT: Slaytlardaki organoidlere dokunmaktan kaçının.
      2. Organoid alanı kaplamak için seyreltilmiş birincil antikoru bırakın. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 ° C'de 8-14 saat nem odasında inkübe edin. Bu adımı tekrarlayın.
   5. İkincil antikor inkübasyonu
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için seyreltilmiş HRP ikincil antikorunu bırakın. Oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrarlayın.
   6. DAB (3,3′-Diaminobenzidin) boyama
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için 1× DAB bırakın. Renk kahverengiye dönene kadar oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edin.
      2. Renk değişimini sonlandırmak için slaytları 5-10 saniye damıtılmış suya batırın. Adımı tekrarlayın.
   7. Hematoksilen boyama
      1. Hematoksilen içinde 5-8 dakika boyayın. 5-10 s boyunca% 1 asit alkolde (% 70 alkolde% 1 HCl) farklılaştırın.
      2. Slaytları 5-10 saniye damıtılmış suya batırın. Bu adımı tekrarlayın.
   8. Dehidratasyon
      1. Slaytları cam tepsilerden sırayla işleyin: 5 dakika boyunca %75 etanole daldırın, 5 dakika boyunca %85 etanole aktarın, 5 dakika boyunca %95 etanole geçin, ardından her biri 10 dakika boyunca %100 etanole iki ayrı daldırma yapın ve son olarak iki ardışık 20 dakikalık periyot boyunca ksilen içine yerleştirin.
   9. Sürgülü montaj
      1. Şeffaf hale gelene kadar nötr sakıza ksilen ekleyin. Havayla hafifçe kurulayın. Ardından, organoid alanı kaplamak için ksilen ile sakız damlatın.
      2. Lamel uygulayın. Slaydı tarayın ve analiz edin.
3. Multipleks immünofloresan (mIF) boyama
   1. Mum alma ve hidrasyon için adım 5.2.1'i tekrarlayın.
   2. Peroksidaz blokajı için adım 5.2.3'ü tekrarlayın.
   3. Antijen alımı için adım 5.2.3'ü tekrarlayın.
   4. Koyun serumu blokajı.
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için koyun serumu bloke edici solüsyon ekleyin. Oda sıcaklığında bir nem odasında 30 dakika inkübe edin.
      2. PBST'de 2 dakika yıkayın. İki kez tekrarlayın.
   5. Primer antikor inkübasyonu için adım 5.2.4'ü tekrarlayın.
   6. İkincil antikor inkübasyonu için adım 5.2.4.1'i tekrarlayın.
      1. Organoid alanı kaplamak için spesifik ikincil antikor solüsyonu bırakın. Oda sıcaklığında bir nem odasında 20 dakika inkübe edin. Adım 5.2.3.2'yi tekrarlayın.
         NOT: Bu adımdan deneyin sonuna kadar slaytları ışıktan koruyun.
   7. Floresan boya boyama
      1. Adım 5.3.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için floresan boya solüsyonu damlatın.
      2. Oda sıcaklığında bir nem odasında 10-20 dakika inkübe edin. Adım 5.2.3.2'yi tekrarlayın.
   8. Çoklu boyama için 5.3.3-5.3.7 adımlarını tekrarlayın.
   9. DAPI boyama
      1. Adım 5.2.4.1'i tekrarlayın. Organoid alanı kaplamak için DAPI solüsyonunu bırakın. Adım 5.2.3.2'yi tekrarlayın. Ardından, 5.3.4.2 adımını tekrarlayın.
      2. Slaytları 2 dakika sterilize suya batırın.
   10. Sürgülü montaj
       1. Organoid alanı kaplamak için damla antifade montaj ortamı. Lamel uygulayın.
   11. Bir slayt tarayıcı kullanarak dijital görüntüler elde edin ve bunları analiz edin.

Sonuçlar

Bu protokol, ESCC tümör oluşumunun farklı aşamalarında organoid örneklemesi ve histolojik analizi tanımlar (Şekil 1). ESCC hastalarından normal özofagus mukozası, düşük dereceli intraepitelyal neoplazi (LGIN), yüksek dereceli intraepitelyal neoplazi (HGIN) ve tümör dokularından numune alınarak, tümör oluşumunun farklı aşamalarını temsil eden organoidler oluşturulabilir. Ayrıca, bu organoidlerin parafin gömülmesi ve kesitlendiri...

Tartışmalar

Organoidlerin kurulması ve histolojik analizi, tümör ilerlemesinin modellenmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Protokol, tümör^{oluşumu 20'yi} incelemek için mevcut yöntemlere göre önemli avantajlar sunmaktadır. Geleneksel 2D hücre kültürü sistemlerinden farklı olarak, organoidler, in vivo koşulları daha iyi yansıtan karmaşık üç boyutlu mimariyi ve hücresel heterojenliği korur. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck	Cat#SLGPR33RB
24-well plate	Corning	Cat#3524
4% Paraformaldehyde	Beyotime	Cat# P0099
70 μm sterile strainer	Falcon	Cat#352350
A83-01	Tocris Bioscience	Cat# 2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	Cat# 12634028
Agar	Solarbio	Cat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)	Gibco	Cat# 15240062
B-27 supplement	Gibco	Cat# 17504044
CO2 incubator	Thermo	Cat#371GPCN
Collagenase IV	Gibco	Cat# 17104019
Cryostor	STEMCELL	Cat# 07930
DMEM	Corning	Cat# 10-013-CV
EGF	Gibco	Cat# PHG0313
Fetal bovine serum	Cell Technologies	Cat# 30070
G-418	Sigma	Cat# A1720
Gelatin	Solarbio	Cat# G8061
GlutaMAX	Gibco	Cat# 35050061
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	Cat# 354230
HE staining kit	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd	NA
HEPES	Gibco	Cat# 15630080
Histological pen	Zsbio	Cat#ZLI-9305
Hygromycin B	Sigma	Cat# 400050
Immunohistochemical staining kit	ZSGB-BIO	PV-8000
L-WRN	ATCC	CRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 supplement	Gibco	Cat# 17502048
Neutral gum	Zsbio	Cat#ZLI-9555
Opal 5-Color Manual IHC Kit	PANOVUE	Cat# 10144100100
PBS	MeilunBio	Cat#MA0015
Rabbit Monoclone anti-PD-L1	CST	Cat# 13684; RRID:AB_2687655
Rabbit Polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# ab16667; RRID:AB_302459
Rabbit Polyclonal anti-KRT6A	Proteintech	Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Sheep serum	Zsbio	Cat#ZLI-9056
TrypLE Express	Gibco	Cat# 12604021
TrypLE-EDTA	Gibco	Cat#15400-054
Whole slide image scanner	Hamamatsu	Cat#C13210
Y-27632	Selleck Chemicals	Cat# S1049