Estabelecimento e Análise Histológica de Organoides Esofágicos Modelando a Progressão de Tecidos Normais para Cancerosos

Resumo

O presente protocolo descreve o estabelecimento e a análise histológica de modelos organoides esofágicos que representam diferentes estágios da progressão tumoral. Este método permite que os pesquisadores estudem mudanças na morfologia celular, organização espacial e padrões de expressão de marcadores moleculares durante a transição de tecidos normais para cancerígenos.

Resumo

Os organoides surgiram como uma ferramenta fundamental para avançar na compreensão da tumorigênese e da terapia do câncer. Ao gerar modelos organoides humanos representando diferentes estágios do tumor e realizar análises histológicas, é possível obter uma compreensão mais profunda das alterações na morfologia celular, arquitetura espacial e expressão de marcadores moleculares importantes à medida que o tumor progride. Este estudo apresenta um protocolo abrangente para o estabelecimento e cultura de organoides de células escamosas esofágicas. Além disso, o protocolo descreve métodos para avaliar os padrões de expressão e organização espacial de moléculas críticas dentro dos organoides, utilizando técnicas como fixação, incorporação e coloração. Por meio desse protocolo, foram identificadas alterações significativas na estrutura espacial das células epiteliais escamosas do esôfago e na expressão de vários biomarcadores tumorais durante a tumorigênese. O protocolo facilita a construção e análise histológica de organoides, permitindo aos pesquisadores investigar a arquitetura espacial e as alterações moleculares das células epiteliais em diferentes estágios de tumorigênese e intervenção terapêutica.

Introdução

A tumorigênese é um processo complexo, de múltiplos estágios, caracterizado por alterações moleculares e morfológicas progressivas nas células ^1,2. O carcinoma espinocelular de esôfago (CEC), uma neoplasia maligna prevalente com mau prognóstico ^3,4, exemplifica essa progressão gradual através de quatro estágios distintos: mucosa normal, neoplasia intraepitelial de baixo grau (LGIN), neoplasia intraepitelial de alto grau (HGIN) e carcinoma invasivo⁵. Ao longo desses estágios, as células epiteliais exibem mudanças dinâmicas nos padrões de expressão molecular e na organização espacial, acompanhadas por alterações sistemáticas na morfologia do tecido à medida que avança de um estado normal para um maligno ^6,7. Apesar dos avanços na compreensão da patogênese do CEC, a falta de modelos experimentais que recapitulem fielmente os aspectos espaciais e temporais da evolução do tumor - ao mesmo tempo em que permitem análises histológicas e moleculares sistemáticas - tem dificultado uma compreensão mecanicista mais profunda da progressão da doença e do desenvolvimento terapêutico.

Embora as linhagens de células cancerígenas imortalizadas 2D tenham feito contribuições significativas para a compreensão da oncogênese, elas são inerentemente limitadas na replicação da complexidade biológica e das características patológicas dos tumores nativos⁸. Os modelos animais, embora forneçam contexto in vivo, muitas vezes preveem mal as respostas humanas devido a diferenças específicas da espécie⁹. Em contraste, os organoides surgiram como uma plataforma pré-clínica transformadora que preserva fielmente a heterogeneidade celular, a arquitetura e a funcionalidade dos tecidos humanos 10,11,12,13. Como modelos pré-clínicos, os organoides capturam melhor as características dos tumores primários, permitindo a investigação detalhada dos principais eventos moleculares e alterações celulares durante a progressão do tumor¹⁴. Por exemplo, Chen et al. utilizaram organoides esofágicos derivados de pacientes de diferentes estágios de ESCC para elucidar as interações epitelial-fibroblastos, validando o eixo de sinalização ANXA1-FPR2 como um fator crítico da patogênese do ESCC⁶. Da mesma forma, Ko et al. empregaram organoides esofágicos geneticamente modificados para identificar os principais determinantes genéticos que impulsionam a iniciação do CEC e a evasão imunológica, demonstrando como os modelos organoides podem efetivamente recapitular as características da doença e revelar novos alvos terapêuticos¹⁵.

A presente metodologia resolve questões significativas na modelagem do câncer de esôfago, estabelecendo um protocolo reprodutível para gerar organoides ESCC de múltiplos estágios que espelham a progressão histológica do epitélio normal para o carcinoma invasivo. Este sistema integra condições de cultura otimizadas usando um meio condicionado por L-WRN para manter a estaminalidade epitelial, combinado com protocolos padronizados para processamento histológico e análise de imunofluorescência multiplex (mIF), fornecendo uma plataforma ideal para analisar longitudinalmente as mudanças espaciais e moleculares durante a tumorigênese. Em comparação com técnicas alternativas, como culturas 2D, essa plataforma organoide preserva exclusivamente a arquitetura do tecido, permitindo a visualização de marcadores moleculares espacialmente organizados, incluindo a proteína de checkpoint imunológico PD-L1 (CD274), que medeia a evasão imune do tumor inibindo as respostas das células T^{16 , 17 , 18}, e o marcador de proliferação Ki-67. O protocolo permite a passagem de organoides de tecidos esofágicos normais e pré-cancerosos, ajudando os pesquisadores a construir um modelo organoide contínuo do tecido normal para o tumor¹⁹. Ao permitir uma análise detalhada das mudanças espaciais e moleculares durante a tumorigênese, este protocolo oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para entender os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e progressão do câncer, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.

Essa metodologia é particularmente adequada para pesquisadores que investigam carcinogênese epitelial, interações com microambientes tumorais ou respostas terapêuticas em CEC e neoplasias escamosas relacionadas. Seu design modular permite a adaptação para estudar outros marcadores moleculares ou vias de sinalização, desde que sejam incorporadas etapas de validação apropriadas. Ao oferecer uma plataforma padronizada e flexível, este protocolo visa avançar a pesquisa pré-clínica em biologia tumoral e acelerar a tradução de insights mecanicistas em terapias direcionadas.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital do Câncer da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Aprovação nº 20/069–2265, 22/221-3423 e 23/305-4047). Amostras de tecido esofágico foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia ou triagem precoce para carcinoma de células escamosas de esôfago (ESCC) no Hospital do Câncer, Academia Chinesa de Ciências Médicas entre 2021 e 2024, com o objetivo de estabelecer organoides esofágicos humanos. Nenhum dos pacientes incluídos neste estudo havia recebido quimioterapia ou radioterapia antes da coleta da amostra. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes e informações clínicas relevantes foram recuperadas dos prontuários médicos. Uma lista completa de reagentes e equipamentos usados neste estudo é fornecida na Tabela de Materiais.

1. Preparação de organoides epiteliais esofágicos

1. Preparação de meio condicionado com L-WRN
   1. Preparação da linhagem celular L-WRN
      1. Descongelar a linhagem celular L-WRN (armazenamento a -80 °C) em banho-maria a 37 °C durante 1-2 min. Misture com 5 mL de meio de cultura basal pré-aquecido (DMEM suplementado com 10% de FBS).
      2. Centrifugue a mistura a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT).
      3. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células com 2-3 mL de meio de seleção fresco pré-aquecido (DMEM contendo 10% de FBS, 0,5 mg / mL de higromicina B e 0,5 mg / mL de G-418).
         NOTA: Mantenha o meio a 4 °C (armazenamento máximo de 1 mês).
      4. Transferir as células para uma placa de cultura de 10 cm contendo o meio de selecção. Cultivar as células a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO₂ .
   2. Passagem da linhagem celular L-WRN
      1. Dissocie as células confluentes usando tripsina-EDTA a 0,025% (1-2 min a 37 ° C) e divida na proporção de 1: 2.
   3. Coleta do meio condicionado L-WRN
      1. Substitua o meio de cultura por meio de cultura basal a 80% de confluência celular. Transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação.
      2. Filtre através da membrana de 0,22 μm para eliminar os detritos celulares. Colete o filtrado como um meio condicionado por L-WRN.
         NOTA: Mantenha o meio condicionado com L-WRN a 4 ° C (1 semana) ou a -80 ° C (6 meses).
2. Preparação de meio de cultura organoide esofágico humano (H-EOCM)
   1. Preparação do H-EOCM
      1. Vórtice o meio condicionado por L-WRN (volume de 1,5 mL) após 4 h de equilíbrio a 4 ° C.
      2. Combine o meio DMEM/F12 avançado com estes aditivos para criar H-EOCM: meio condicionado a 3% de L-WRN, 1× Anti-Anti, 1× L-glutamina, 1× suplemento de N2, 1× suplemento de B27, 0,15 mM HEPES, 40 ng/mL EGF, 10 μM Y-27632 e 50 μM A83-01.
         NOTA: Mantenha o armazenamento congelado de H-EOCM a -20 ° C para preservação de seis meses.
3. Preparação pré-experimental
   1. Descongele o H-EOCM mantendo-o a 4 °C durante 4 h.

2. Estabelecimento do organoide esofágico humano

1. Preparação de materiais
   1. Descongelar a matriz da membrana basal e o H-EOCM a 4 °C. Esterilize tesouras e pinças cirúrgicas para o próximo experimento.
   2. Pré-arrefecer as ponteiras da pipeta a 4 °C. Pré-aqueça a placa de 24 poços a 37 °C.
2. Processamento de tecidos e isolamento celular
   NOTA: Tecido tumoral ESCC, lesões displásicas (≤2 cm da margem do tumor) e tecido esofágico normal compatível (≥5 cm da margem do tumor) foram coletados dos mesmos indivíduos com ESC submetidos à ressecção cirúrgica. Além disso, amostras esofágicas em múltiplos estágios foram obtidas por meio de um programa de detecção precoce e triagem de ESCC, conforme descrito em nossos estudos anteriores ^6,7.
   1. Limpe a amostra com tampão de lavagem à temperatura ambiente (PBS contendo 1×Anti-Anti e HEPES 0,15 mM) em tubos de centrífuga de 5 mL três vezes.
      NOTA: Lave as amostras mais de três vezes para reduzir o risco de contaminação.
   2. Pique o tecido em fragmentos de 1 mm³ usando uma tesoura estéril. Transfira os fragmentos para tubos de centrífuga de 1,5 mL.
   3. Suspenda a amostra com 1 mL de tampão de digestão e agite-a a 37 °C, 50-100 rpm, por 10-20 min para digerir o tecido.
   4. Centrifugue a mistura a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   5. Ressuspenda o precipitado em 500 μL de tripsina-EDTA a 0,025%. Incubar a 37 °C durante 10 min. Adicione 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS para interromper a atividade enzimática.
   6. Passe a suspensão por um filtro estéril de 70 μm. Recolha o filtrado num tubo de centrifugação de 1,5 ml.
   7. Centrifugar o filtrado durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células com 100 μL de H-EOCM.
3. Semeadura de organoides
   1. Determine a densidade celular e, em seguida, prepare um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL com 5.000-15.000 células em suspensão.
   2. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda suavemente as células em 50-100 μL de matriz da membrana basal uniformemente.
      NOTA: Armazene a matriz da membrana basal a 4 °C para evitar solidificação.
   3. Adicione 50 μL de matriz de membrana basal com as células mistas ao centro de cada placa de 24 poços. Polimerizar a matriz da membrana basal através de incubação a 37 °C (duração de 30 min).
   4. Adicione 500 μL de H-EOCM pré-aquecido (37 °C) para cobrir a matriz da membrana basal. Cultivar os organoides em uma incubadora umidificada de CO_{5% 2} a 37 °C.
4. Substituição de mídia
   1. Aspirar o meio gasto e reabastecer com 500 μl de H-EOCM fresco (aquecido a 37 °C).
      NOTA: Substitua o H-EOCM em intervalos de 3 dias.

3. Passagem de organoides

1. Preparação de materiais
   1. Descongelar a matriz da membrana basal e o H-EOCM a 4 °C. Pré-arrefecer as ponteiras da pipeta a 4 °C. Pré-aqueça a placa de 24 poços a 37 °C.
2. Digestão de organoides
   1. Remova o meio H-EOCM com cuidado. Adicione 500 μL de tampão de passagem pré-resfriado (DMEM/F12 avançado contendo 1× Anti-Anti e HEPES 0,15 mM, pré-resfriado a 4 °C) no poço para derreter a matriz da membrana basal.
   2. Combine a matriz da membrana basal com o tampão de passagem em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Lave o poço com 500 μL de tampão de passagem pré-resfriado e colete o tampão para recuperar quaisquer organoides restantes.
   3. Centrifugue o tampão durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Aspirar suavemente o sobrenadante. Adicione 500 μL de tripsina recombinante no tubo e incube para digestão enzimática (37 °C, 15 min). Ressuspenda em intervalos de 5 minutos.
   4. Centrifugar a amostra digerida (400 x g, 5 min, 4 °C). Descarte o sobrenadante. Repita as etapas 3.2.6 e 3.2.7. Ressuspenda as células em 100 μL de H-EOCM.
3. Semeadura de organoides
   1. Para a semeadura de organoides, repita a etapa 2.3.

4. Congelamento e recuperação de organoides

1. Congelamento de organoides
   1. Para a preparação dos materiais, repita o passo 2.1.
   2. Para a digestão dos organoides, repita a etapa 3.2.
   3. Congelamento de organoides
      1. Determine a densidade celular e, em seguida, prepare um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL com 10.000 células em suspensão.
      2. Centrifugar as amostras a 400 x g durante 5 min a RT. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
      3. Ressuspenda as células com 500-1000 μL de meio de criopreservação. Transfira para um novo criotubo. Congelar o criotubo a -80 °C durante 24 h. Arquivar em um sistema de armazenamento de nitrogênio líquido para preservação prolongada.
2. Descongelamento de organoide de congelamento
   1. Para a preparação dos materiais, repita a etapa 2.1.
   2. Descongelamento de organoide de congelamento
      1. Descongele rapidamente o criotubo em banho-maria a 37 °C por 2-3 min. Transferir o material congelado para 9 ml de cultura basal pré-aquecida (37 °C) e ressuspender as células uniformemente.
      2. Centrifugar a suspensão da célula durante 5 min a 400 x g (à RT). Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
   3. Semeadura de organoides
      1. Para semear os organoides, repita a etapa 2.3.

5. Análise histológica do organoide

1. Preparação de seções embebidas em parafina
   1. Preparação de materiais
      1. Esterilizar 50 mL de matriz de inclusão (solução aquosa: ágar 2% + gelatina 2,5%) em um frasco de 250 mL via autoclave. Alíquota de 5 mL em tubos de centrífuga de 15 mL. Armazene em temperatura ambiente.
   2. Fixação de organoides
      1. Repita as etapas 3.2.1-3.2.2. Ressuspenda o precipitado com 1 mL de tampão de passagem em um novo tubo de 1,5 mL.
      2. Centrifugue a 400 x g a 4 °C por 5 min. Remova o sobrenadante. Ressuspenda os organoides em 500 μL de paraformaldeído a 4% (PFA). Incubar à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 °C durante, pelo menos, 6 h.
   3. Incorporação de organoides
      1. Centrifugue a mistura (400 x g, 5 min, RT). Remova o sobrenadante. Adicione 1 mL do tampão de passagem no tubo e ressuspenda a precipitação.
      2. Centrifugue a mistura (400 x g, 5 min, RT). Remova o sobrenadante.
      3. Coloque um tubo (15 mL) com meio de inclusão (5 mL) no banho-maria (recipiente de 100 mL, 150 mL). Microondas na potência máxima até que a água comece a ferver.
         NOTA: Desaperte a tampa do tubo de 15 mL antes de colocar no micro-ondas.
      4. Ressuspenda os organoides com 50 μL de gel de inclusão em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Arrefecer o tubo a 4 °C até que o gel endureça completamente.
      5. Transfira o gel solidificado para etanol a 70%. Conservar a 4 °C.
   4. Preparação de blocos de parafina
      1. Desidratar o gel através de séries de etanol (30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%), 30 min por concentração.
      2. Coloque o gel solidificado em xileno transparente por 30 min. Mergulhe o gel solidificado em parafina e incorpore-o usando uma estação de parafina aquecida.
      3. Corte fatias de 4 μm de espessura com um micrótomo. Montar em lâminas e secar a 65 °C durante 1 h. Armazene em condições secas.
2. Coloração imuno-histoquímica (IHQ) de fatias organoides
   1. Desparafinação e hidratação
      1. Aqueça as fatias no agente de limpeza de tecidos a 65 °C por 40 min. Mergulhe a lâmina em agente de limpeza de tecido fresco à temperatura ambiente por 20 min.
      2. Processe as lâminas através de bandejas de vidro contendo séries de etanol: mergulhe em etanol 100% por 10 min e repita uma vez, depois transfira para etanol 95% por 5 min, seguido de etanol 85% por 5 min, depois etanol 75% por 5 min e, finalmente, coloque em PFA 4% por 10 min.
      3. Adicione água esterilizada à câmara termoestável e mantenha 5 min no agitador a 80 rpm. Repita esta etapa duas vezes.
   2. Recuperação de antígeno
      1. Adicione a solução de recuperação do antígeno Tris-EDTA (pH 9,0) à câmara termoestável para imergir as lâminas. Microondas a câmara termoestável contendo as lâminas na intensidade máxima (700 W, 3 min) até ferver. Mantenha o micro-ondas em baixa potência (70 W, 15 min) e resfrie até a temperatura ambiente.
      2. Lave em água destilada por 2 min em uma coqueteleira a 80 rpm. Repita duas vezes. Circule a localização dos organoides com uma caneta histológica.
   3. Bloqueio da peroxidase
      1. Eliminar a solução de bloqueio da peroxidase para cobrir a área da amostra. Incubar em câmara de humidade à temperatura ambiente durante 20 min.
      2. Transfira as lâminas para uma câmara termoestável. Lave em PBST (PBS + 0,1% Tween 20) por 2 min a 80 rpm. Repita duas vezes.
   4. Incubação primária de anticorpos
      1. Limpe suavemente o excesso de gotículas de PBST nas lâminas.
         NOTA: Evite tocar em organoides em slides.
      2. Eliminar o anticorpo primário diluído para cobrir a área organoide. Incubar numa câmara de humidade durante 2 h à temperatura ambiente ou 8-14 h a 4 °C. Repita esta etapa.
   5. Incubação secundária de anticorpos
      1. Repita a etapa 5.2.4.1. Eliminar o anticorpo secundário HRP diluído para cobrir a área organoide. Incubar em câmara de humidade à temperatura ambiente durante 20 min. Repita esta etapa.
   6. Coloração DAB (3,3′-Diaminobenzidina)
      1. Repita a etapa 5.2.4.1. Solte 1× DAB para cobrir a área do organoide. Incube em uma câmara de umidade em temperatura ambiente até que a cor fique marrom.
      2. Mergulhe as lâminas em água destilada por 5 a 10 s para encerrar a mudança de cor. Repita a etapa.
   7. Coloração de hematoxilina
      1. Manchar em hematoxilina por 5-8 min. Diferencie em álcool ácido a 1% (HCl a 1% em álcool a 70%) por 5-10 s.
      2. Mergulhe as lâminas em água destilada por 5-10 s. Repita esta etapa.
   8. Desidratação
      1. Processe as lâminas através de bandejas de vidro em ordem sequencial: mergulhe em etanol a 75% por 5 min, transfira para etanol a 85% por 5 min, passe para etanol a 95% por 5 min, seguido por duas imersões separadas em etanol a 100% por 10 min cada e, finalmente, coloque em xileno por dois períodos sucessivos de 20 min.
   9. Montagem deslizante
      1. Adicione xileno à goma neutra até que fique transparente. Seque ligeiramente ao ar. Em seguida, coloque chiclete com xileno para cobrir a área organoide.
      2. Aplique lamínula. Digitalize e analise o slide.
3. Coloração de imunofluorescência multiplex (mIF)
   1. Para desparafinação e hidratação, repita a etapa 5.2.1.
   2. Para bloqueio da peroxidase, repita a etapa 5.2.3.
   3. Para a recuperação do antigénio, repetir o passo 5.2.3.
   4. Bloqueio do soro de ovelha.
      1. Repita a etapa 5.2.4.1. Adicione solução de bloqueio de soro de ovelha para cobrir a área organoide. Incubar em câmara de umidade em temperatura ambiente por 30 min.
      2. Lave em PBST por 2 min. Repita duas vezes.
   5. Para a incubação primária de anticorpos, repetir o passo 5.2.4.
   6. Para incubação de anticorpos secundários, repita a etapa 5.2.4.1.
      1. Descarte a solução de anticorpo secundário específico para cobrir a área organoide. Incubar em câmara de humidade à temperatura ambiente durante 20 min. Repita a etapa 5.2.3.2.
         NOTA: Proteja as lâminas da luz desta etapa até o final do experimento.
   7. Coloração de corante fluorescente
      1. Repita a etapa 5.3.4.1. Solte a solução de corante fluorescente para cobrir a área organoide.
      2. Incubar em uma câmara de umidade em temperatura ambiente por 10-20 min. Repita a etapa 5.2.3.2.
   8. Para multicoloração, repita as etapas 5.3.3-5.3.7.
   9. Coloração DAPI
      1. Repita a etapa 5.2.4.1. Solte a solução DAPI para cobrir a área organoide. Repita a etapa 5.2.3.2. Em seguida, repita a etapa 5.3.4.2.
      2. Mergulhe as lâminas em água esterilizada por 2 min.
   10. Montagem deslizante
       1. Remova o meio de montagem antidesbotamento para cobrir a área organoide. Aplique lamínula.
   11. Adquira imagens digitais usando um scanner de slides e analise-as.

Resultados

Este protocolo descreve a amostragem de organoides e a análise histológica em diferentes estágios da tumorigênese do CEC (Figura 1). Ao coletar amostras de mucosa esofágica normal, neoplasia intraepitelial de baixo grau (LGIN), neoplasia intraepitelial de alto grau (HGIN) e tecidos tumorais de pacientes com ESCC, organoides representando diferentes estágios de tumorigênese podem ser construídos. Além disso, foi realizada a inclusão e seccionamento ...

Discussão

O estabelecimento e a análise histológica dos organoides representam um avanço significativo na modelagem da progressão tumoral. O protocolo oferece vantagens notáveis sobre os métodos existentes para estudar a tumorigênese²⁰. Ao contrário dos sistemas tradicionais de cultura de células 2D, os organoides mantêm uma arquitetura tridimensional complexa e heterogeneidade celular que refletem melhor as condições in vivo. Em comparação com os mod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck	Cat#SLGPR33RB
24-well plate	Corning	Cat#3524
4% Paraformaldehyde	Beyotime	Cat# P0099
70 μm sterile strainer	Falcon	Cat#352350
A83-01	Tocris Bioscience	Cat# 2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	Cat# 12634028
Agar	Solarbio	Cat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)	Gibco	Cat# 15240062
B-27 supplement	Gibco	Cat# 17504044
CO2 incubator	Thermo	Cat#371GPCN
Collagenase IV	Gibco	Cat# 17104019
Cryostor	STEMCELL	Cat# 07930
DMEM	Corning	Cat# 10-013-CV
EGF	Gibco	Cat# PHG0313
Fetal bovine serum	Cell Technologies	Cat# 30070
G-418	Sigma	Cat# A1720
Gelatin	Solarbio	Cat# G8061
GlutaMAX	Gibco	Cat# 35050061
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	Cat# 354230
HE staining kit	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd	NA
HEPES	Gibco	Cat# 15630080
Histological pen	Zsbio	Cat#ZLI-9305
Hygromycin B	Sigma	Cat# 400050
Immunohistochemical staining kit	ZSGB-BIO	PV-8000
L-WRN	ATCC	CRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 supplement	Gibco	Cat# 17502048
Neutral gum	Zsbio	Cat#ZLI-9555
Opal 5-Color Manual IHC Kit	PANOVUE	Cat# 10144100100
PBS	MeilunBio	Cat#MA0015
Rabbit Monoclone anti-PD-L1	CST	Cat# 13684; RRID:AB_2687655
Rabbit Polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# ab16667; RRID:AB_302459
Rabbit Polyclonal anti-KRT6A	Proteintech	Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Sheep serum	Zsbio	Cat#ZLI-9056
TrypLE Express	Gibco	Cat# 12604021
TrypLE-EDTA	Gibco	Cat#15400-054
Whole slide image scanner	Hamamatsu	Cat#C13210
Y-27632	Selleck Chemicals	Cat# S1049