Etablierung und histologische Analyse von Ösophagusorganoiden zur Modellierung des Verlaufs von normalem zu krebsartigem Gewebe

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung und histologische Analyse von Organoidmodellen der Speiseröhre, die verschiedene Stadien der Tumorprogression repräsentieren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Veränderungen in der zellulären Morphologie, der räumlichen Organisation und den Expressionsmustern molekularer Marker während des Übergangs von normalem zu krebsartigem Gewebe zu untersuchen.

Zusammenfassung

Organoide haben sich zu einem zentralen Werkzeug entwickelt, um das Verständnis der Tumorentstehung und der Krebstherapie zu verbessern. Durch die Generierung humaner Organoidmodelle, die verschiedene Tumorstadien repräsentieren, und die Durchführung histologischer Analysen ist es möglich, ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der zellulären Morphologie, der räumlichen Architektur und der Expression wichtiger molekularer Marker im Laufe des Tumors zu erlangen. Diese Studie stellt ein umfassendes Protokoll für die Etablierung und Kultivierung von Plattenepithel-Organoiden der Speiseröhre vor. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll Methoden zur Bewertung der Expressionsmuster und der räumlichen Organisation kritischer Moleküle innerhalb der Organoide unter Verwendung von Techniken wie Fixierung, Einbettung und Färbung. Durch dieses Protokoll wurden signifikante Veränderungen in der räumlichen Struktur von Plattenepithelzellen der Speiseröhre und in der Expression verschiedener Tumorbiomarker während der Tumorgenese identifiziert. Das Protokoll erleichtert die Konstruktion und histologische Analyse von Organoiden und ermöglicht es den Forschern, die räumliche Architektur und die molekularen Veränderungen von Epithelzellen in verschiedenen Stadien der Tumorgenese und der therapeutischen Intervention zu untersuchen.

Einleitung

Die Tumorgenese ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, der durch fortschreitende molekulare und morphologische Veränderungen in Zellen gekennzeichnet^{ist 1,2}. Das Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre (ESCC), eine weit verbreitete bösartige Erkrankung mit schlechter Prognose ^3,4, ist ein Beispiel für diesen schrittweisen Verlauf durch vier verschiedene Stadien: normale Schleimhaut, niedriggradige intraepitheliale Neoplasie (LGIN), hochgradige intraepitheliale Neoplasie (HGIN) und invasives Karzinom⁵. Während dieser Stadien zeigen Epithelzellen dynamische Veränderungen in den molekularen Expressionsmustern und der räumlichen Organisation, begleitet von systematischen Veränderungen der Gewebemorphologie, wenn es von einem normalen zu einem bösartigen Zustand übergeht ^6,7. Trotz Fortschritten im Verständnis der ESCC-Pathogenese hat der Mangel an experimentellen Modellen, die räumliche und zeitliche Aspekte der Tumorevolution getreu rekapitulieren und gleichzeitig systematische histologische und molekulare Analysen ermöglichen, ein tieferes mechanistisches Verständnis des Krankheitsverlaufs und der therapeutischen Entwicklung behindert.

Während 2D-immortalisierte Krebszelllinien einen bedeutenden Beitrag zum Verständnis der Onkogenese geleistet haben, sind sie von Natur aus nur begrenzt in der Lage, die biologische Komplexität und die pathologischen Merkmale nativer Tumoren zu replizieren⁸. Tiermodelle liefern zwar einen In-vivo-Kontext, können aber die Reaktionen des Menschen aufgrund artspezifischer Unterschiede oft schlecht vorhersagen⁹. Im Gegensatz dazu haben sich Organoide als transformative präklinische Plattform herausgestellt, die die zelluläre Heterogenität, Architektur und Funktionalität des menschlichen Gewebes originalgetreu bewahrt 10,11,12,13. Als präklinische Modelle erfassen Organoide die Eigenschaften von Primärtumoren besser und ermöglichen eine detaillierte Untersuchung wichtiger molekularer Ereignisse und zellulärer Veränderungen während der Tumorprogression¹⁴. Zum Beispiel verwendeten Chen et al. von Patienten stammende Speiseröhrenorganoide aus verschiedenen Stadien der ESCC, um Epithel-Fibroblasten-Interaktionen aufzuklären und schließlich die ANXA1-FPR2-Signalachse als kritischen Treiber der ESCC-Pathogenese zu validieren⁶. In ähnlicher Weise setzten Ko et al. gentechnisch veränderte Organoide der Speiseröhre ein, um wichtige genetische Determinanten zu identifizieren, die die ESCC-Initiation und Immunevasion antreiben, und zeigten, wie Organoidmodelle Krankheitsmerkmale effektiv rekapitulieren und neue therapeutische Ziele aufdecken können¹⁵.

Die vorliegende Methodik löst wichtige Probleme bei der Modellierung von Speiseröhrenkrebs, indem sie ein reproduzierbares Protokoll zur Erzeugung von mehrstufigen ESCC-Organoiden etabliert, die die histologische Progression vom normalen Epithel zum invasiven Karzinom widerspiegeln. Dieses System integriert optimierte Kulturbedingungen unter Verwendung eines L-WRN-konditionierten Mediums zur Aufrechterhaltung der epithelialen Stammheit, kombiniert mit standardisierten Protokollen für die histologische Prozessierung und die Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF)-Analyse und bietet eine ideale Plattform für die Längsschnittanalyse räumlicher und molekularer Veränderungen während der Tumorgenese. Im Vergleich zu alternativen Techniken wie 2D-Kulturen bewahrt diese Organoid-Plattform auf einzigartige Weise die Gewebearchitektur und ermöglicht die Visualisierung räumlich organisierter molekularer Marker, einschließlich des Immun-Checkpoint-Proteins PD-L1 (CD274), das die Immunevasion des Tumors durch Hemmung der T-Zell-Antworten vermittelt 16,17,18 und der Proliferationsmarker Ki-67. Das Protokoll ermöglicht die Passage von Organoiden aus normalem Ösophagus- und Krebsvorgewebe und hilft den Forschern, ein kontinuierliches Organoidmodell vom normalen Gewebe bis zum Tumor¹⁹ zu erstellen. Durch die detaillierte Analyse räumlicher und molekularer Veränderungen während der Tumorgenese bietet dieses Protokoll den Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der Mechanismen, die der Krebsentstehung und -progression zugrunde liegen, was möglicherweise zu verbesserten therapeutischen Strategien führt.

Diese Methodik eignet sich besonders für Forscher, die die Epithelkarzinogenese, Wechselwirkungen zwischen Tumormikroumgebungen oder therapeutisches Ansprechen bei ESCC und verwandten Plattenepitheltumoren untersuchen. Sein modularer Aufbau ermöglicht die Anpassung an die Untersuchung anderer molekularer Marker oder Signalwege, sofern geeignete Validierungsschritte einbezogen werden. Durch das Angebot einer standardisierten und dennoch flexiblen Plattform zielt dieses Protokoll darauf ab, die präklinische Forschung in der Tumorbiologie voranzutreiben und die Umsetzung mechanistischer Erkenntnisse in zielgerichtete Therapien zu beschleunigen.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Krebskrankenhauses der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften genehmigt (Zulassungsnummern 20/069–2265, 22/221-3423 und 23/305-4047). Ösophagusgewebeproben wurden von Patienten entnommen, die sich zwischen 2021 und 2024 am Krebskrankenhaus der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften einer Operation oder einem frühen Screening auf Plattenepithelkarzinome der Speiseröhre (ESCC) unterzogen haben, um humane Ösophagusorganoide zu etablieren. Keiner der in diese Studie eingeschlossenen Patienten hatte vor der Probenentnahme eine Chemo- oder Strahlentherapie erhalten. Von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt, und relevante klinische Informationen wurden aus den Krankenakten abgerufen. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte finden Sie in der Materialtabelle.

1. Herstellung von Organoiden aus dem Speiseröhrenepithel

1. Aufbereitung von L-WRN-konditioniertem Medium
   1. Vorbereitung der L-WRN-Zelllinie
      1. Auftauen der L-WRN-Zelllinie (Lagerung bei -80 °C) in einem 37 °C Wasserbad für 1-2 min. Mischen Sie mit 5 mL vorgewärmtem Basalkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS).
      2. Die Mischung bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
      3. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen mit 2-3 ml frischem, vorgewärmtem Selektionsmedium (DMEM mit 10 % FBS, 0,5 mg/ml Hygromycin B und 0,5 mg/ml G-418).
         HINWEIS: Bewahren Sie das Medium bei 4 °C auf (maximale Lagerung 1 Monat).
      4. Die Zellen werden in eine 10-cm-Kulturschale mit dem Selektionsmedium überführt. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator.
   2. Passage der L-WRN-Zelllinie
      1. Dissoziieren Sie konfluente Zellen mit 0,025 % Trypsin-EDTA (1-2 min bei 37 °C) und teilen Sie sie im Verhältnis 1:2.
   3. Sammlung des L-WRN-konditionierten Mediums
      1. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein basales Kulturmedium bei 80 % Zellkonfluenz. Den Überstand in ein Zentrifugenröhrchen umfüllen.
      2. Filtert durch eine 0,22 μm große Membran, um Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat als L-WRN-konditioniertes Medium.
         HINWEIS: L-WRN-konditioniertes Medium bei 4 °C (1 Woche) oder -80 °C (6 Monate) lagern.
2. Zubereitung des humanen Organoid-Kulturmediums der Speiseröhre (H-EOCM)
   1. Vorbereitung H-EOCM
      1. Das L-WRN-konditionierte Medium (1,5 mL Volumen) wird nach 4 h Äquilibrierung bei 4 °C vortext.
      2. Kombinieren Sie Advanced DMEM/F12-Medium mit diesen Additiven, um H-EOCM zu erhalten: 3 % L-WRN-konditioniertes Medium, 1× Anti-Anti, 1× L-Glutamin, 1× N2-Supplement, 1× B27-Supplement, 0,15 mM HEPES, 40 ng/mL EGF, 10 μM Y-27632 und 50 μM A83-01.
         HINWEIS: Halten Sie die Tiefkühllagerung von H-EOCM bei -20° C für eine sechsmonatige Konservierung.
3. Vorbereitung vor dem Versuch
   1. H-EOCM abtauen, indem es 4 h lang bei 4 °C gehalten wird.

2. Etablierung des humanen Ösophagusorganoids

1. Vorbereitung der Materialien
   1. Tauen Sie die Basalmembranmatrix und H-EOCM bei 4 °C auf. Sterilisieren Sie chirurgische Scheren und Pinzetten für das nächste Experiment.
   2. Die Pipettenspitzen auf 4 °C vorkühlen. Die 24-Well-Platte auf 37 °C vorwärmen.
2. Gewebeaufbereitung und Zellisolierung
   HINWEIS: ESCC-Tumorgewebe, dysplastische Läsionen (≤2 cm vom Tumorrand entfernt) und passendes normales Speiseröhrengewebe (≥5 cm vom Tumorrand) wurden von denselben Personen mit ESCC entnommen, die sich einer chirurgischen Resektion unterzogen hatten. Darüber hinaus wurden mehrstufige Speiseröhrenproben durch ein ESCC-Früherkennungs- und Screening-Programm gewonnen, wie in unseren früheren Studien beschrieben ^6,7.
   1. Reinigen Sie die Probe dreimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur (PBS mit 1×Anti-Anti und 0,15 mM HEPES) in 5-ml-Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Waschen Sie die Proben mehr als dreimal, um das Risiko einer Kontamination zu verringern.
   2. Das Gewebe mit einer sterilen Schere in 1 mm³ Fragmente zerkleinern. Übertragen Sie die Fragmente in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
   3. Suspendieren Sie die Probe mit 1 mL Aufschlusspuffer und schütteln Sie sie bei 37 °C, 50-100 U/min, für 10-20 Minuten, um das Gewebe zu verdauen.
   4. Die Mischung bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand verwerfen.
   5. Resuspendieren Sie den Niederschlag in 500 μl 0,025 % Trypsin-EDTA. Bei 37 °C 10 min inkubieren. Fügen Sie 1 ml DMEM hinzu, ergänzt mit 10% FBS, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.
   6. Die Suspension wird durch einen 70 μm Sterilfilter geleitet. Sammeln Sie das Filtrat in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
   7. Zentrifugieren Sie das Filtrat für 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μl H-EOCM.
3. Organoid-Aussaat
   1. Bestimmen Sie die Zelldichte und bereiten Sie dann ein frisches 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5.000-15.000 Zellen in Suspension vor.
   2. 5 min bei 400 x g bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig ansaugen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50-100 μl Basalmembranmatrix gleichmäßig.
      HINWEIS: Lagern Sie die Basalmembranmatrix bei 4 °C, um eine Verfestigung zu vermeiden.
   3. Geben Sie 50 μl Basalmembranmatrix mit den gemischten Zellen in die Mitte jeder 24-Well-Platte. Polymerisieren Sie die Basalmembranmatrix durch 37 °C Inkubation (30 min Dauer).
   4. 500 μl vorgewärmtes H-EOCM (37 °C) zugeben, um die Basalmembranmatrix zu bedecken. Die Organoide werden in einem befeuchteten 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C kultiviert.
4. Mittlerer Ersatz
   1. Das verbrauchte Medium aspirieren und mit 500 μl frischem H-EOCM (auf 37 °C erwärmt) auffüllen.
      HINWEIS: Tauschen Sie H-EOCM in Abständen von 3 Tagen aus.

3. Passieren von Organoiden

1. Vorbereitung der Materialien
   1. Tauen Sie die Basalmembranmatrix und H-EOCM bei 4 °C auf. Die Pipettenspitzen auf 4 °C abkühlen lassen. Die 24-Well-Platte auf 37 °C vorwärmen.
2. Verdauung von Organoiden
   1. Entfernen Sie das H-EOCM medium vorsichtig. Geben Sie 500 μl vorgekühlten Durchgangspuffer (Advanced DMEM/F12 mit 1× Anti-Anti und 0,15 mM HEPES, vorgekühlt auf 4 °C) in die Vertiefung, um die Basalmembranmatrix zu schmelzen.
   2. Kombinieren Sie die Basalmembranmatrix mit dem Durchgangspuffer in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Vertiefung mit 500 μl vorgekühltem Durchgangspuffer und sammeln Sie den Puffer, um verbleibende Organoide zu gewinnen.
   3. Den Puffer 5 min bei 400 x g bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an. 500 μl rekombinantes Trypsin in das Röhrchen geben und für den enzymatischen Aufschluss inkubieren (37 °C, 15 min). Unterbrechen Sie die Unterbrechung in Abständen von 5 Minuten.
   4. Die aufgeschlossene Probe zentrifugieren (400 x g, 5 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 und 3.2.7. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl H-EOCM.
3. Organoid-Aussaat
   1. Für die Organoid-Aussaat wiederholen Sie Schritt 2.3.

4. Einfrieren und Rückgewinnung von Organoiden

1. Einfrieren von Organoiden
   1. Für die Materialvorbereitung wiederholen Sie Schritt 2.1.
   2. Für die Verdauung der Organoide wiederholen Sie Schritt 3.2.
   3. Einfrieren von Organoiden
      1. Bestimmen Sie die Zelldichte und bereiten Sie dann ein frisches 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10.000 Zellen in Suspension vor.
      2. Die Proben werden bei 400 x g für 5 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig aspiriert.
      3. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500-1000 μl Kryokonservierungsmedium. In ein neues Kryoröhrchen umfüllen. Frieren Sie das Kryoröhrchen bei -80 °C für 24 h ein. Archivierung in einem Flüssigstickstoff-Speicher für eine längere Konservierung.
2. Auftauen von gefrierenden Organoiden
   1. Für die Vorbereitung der Materialien wiederholen Sie Schritt 2.1.
   2. Auftauen von gefrierenden Organoiden
      1. Tauen Sie das Kryoröhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad 2-3 Minuten lang schnell auf. Übertragen Sie das gefrorene Material in 9 mL vorgewärmte Basalkultur (37 °C) und resuspendieren Sie die Zellen gleichmäßig.
      2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 min lang bei 400 x g (bei RT). Den Überstand vorsichtig ansaugen.
   3. Organoid-Aussaat
      1. Für die Aussaat der Organoide wiederholen Sie Schritt 2.3.

5. Histologische Analyse von Organoiden

1. Vorbereitung von paraffineingebetteten Schnitten
   1. Vorbereitung der Materialien
      1. 50 ml Einbettungsmatrix (wässrige Lösung: 2 % Agar + 2,5 % Gelatine) in einem 250-ml-Kolben im Autoklaven sterilisieren. Aliquotieren Sie 5 mL in 15 mL Zentrifugenröhrchen. Bei Raumtemperatur lagern.
   2. Organoid-Fixierung
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.2. Resuspendieren Sie den Niederschlag mit 1 mL Passagepuffer in einem frischen 1,5 mL Röhrchen.
      2. Zentrifugieren Sie bei 400 x g bei 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Organoide in 500 μl 4% Paraformaldehyd (PFA). 1 h bei Raumtemperatur oder mindestens 6 h bei 4 °C inkubieren.
   3. Einbettung von Organoiden
      1. Die Mischung zentrifugieren (400 x g, 5 min, RT). Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 1 mL des Durchgangspuffers in das Röhrchen und resuspendieren Sie die Fällung.
      2. Die Mischung zentrifugieren (400 x g, 5 min, RT). Entfernen Sie den Überstand.
      3. Legen Sie ein Röhrchen (15 mL) mit Einbettmedium (5 mL) in das Wasserbad (100 mL, 150 mL Behälter). Mikrowelle bei maximaler Leistung, bis das Wasser zu kochen beginnt.
         HINWEIS: Schrauben Sie die Kappe des 15-ml-Röhrchens ab, bevor Sie es in die Mikrowelle stellen.
      4. Resuspendieren Sie die Organoide mit 50 μl Einbettungsgel in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Kühlen Sie die Tube auf 4 °C ab, bis das Gel vollständig ausgehärtet ist.
      5. Übertragen Sie das erstarrte Gel in 70% Ethanol. Bei 4 °C lagern.
   4. Zubereitung von Paraffinblöcken
      1. Dehydrieren Sie das Gel durch Ethanol-Serien (30 % → 50 % → 70 % → 80 % → 95 % → 100 %), 30 Minuten pro Konzentration.
      2. Geben Sie das erstarrte Gel 30 Minuten lang in klares Xylol. Tauchen Sie das erstarrte Gel in Paraffin und betten Sie es mit einer erhitzten Paraffinstation ein.
      3. Mit einem Mikrotom 4 μm dicke Scheiben schneiden. Auf Objektträger montieren und 1 h bei 65 °C trocknen. Trocken lagern.
2. Immunhistochemische (IHC) Färbung von Organoidschnitten
   1. Entparaffinierung und Hydratation
      1. Die Scheiben in einem Tuchreiniger bei 65 °C 40 min erhitzen. Tauchen Sie den Objektträger 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in frisches Gewebereinigungsmittel.
      2. Verarbeiten Sie die Objektträger durch Glasschalen, die Ethanol enthalten: 10 Minuten lang in 100 % Ethanol eintauchen und einmal wiederholen, dann 5 Minuten lang auf 95 % Ethanol umfüllen, gefolgt von 85 % Ethanol für 5 Minuten, dann 75 % Ethanol für 5 Minuten und schließlich 10 Minuten lang in 4 % PFA.
      3. Geben Sie sterilisiertes Wasser in die thermostabile Kammer und lassen Sie den Shaker 5 min bei 80 U/min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   2. Antigen-Rückgewinnung
      1. Geben Sie Tris-EDTA-Antigen (pH 9,0) Rückhollösung in die thermostabile Kammer, um die Objektträger einzutauchen. Die thermostabile Kammer mit den Objektträgern bei maximaler Intensität (700 W, 3 min) in der Mikrowelle erhitzen, bis sie siedet. In der Mikrowelle auf niedriger Stufe (70 W, 15 min) weiter erhitzen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      2. In destilliertem Wasser 2 Minuten lang auf einem Shaker bei 80 U/min waschen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal. Kreisen Sie die Position der Organoide mit einem histologischen Stift ein.
   3. Peroxidase-Blockierung
      1. Lassen Sie die Peroxidase-Blockierungslösung auf den Probenbereich fallen. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubieren.
      2. Übertragen Sie die Objektträger in eine thermostabile Kammer. In PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) 2 min bei 80 U/min waschen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
   4. Inkubation von Primärantikörpern
      1. Wischen Sie die überschüssigen PBST-Tröpfchen auf den Objektträgern vorsichtig ab.
         HINWEIS: Vermeiden Sie es, Organoide auf Objektträgern zu berühren.
      2. Lassen Sie den verdünnten Primärantikörper fallen, um den Organoidbereich abzudecken. In einer Feuchtigkeitskammer 2 h bei Raumtemperatur oder 8-14 h bei 4 °C inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   5. Inkubation von sekundären Antikörpern
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.2.4.1. Lassen Sie den verdünnten HRP-Sekundärantikörper fallen, um den Organoidbereich abzudecken. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   6. DAB-Färbung (3,3′-Diaminobenzidin)
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.2.4.1. Lassen Sie 1× DAB fallen, um den Organoidbereich abzudecken. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur inkubieren, bis die Farbe braun wird.
      2. Tauchen Sie die Objektträger 5-10 s lang in destilliertes Wasser, um die Farbveränderung zu beenden. Wiederholen Sie den Schritt.
   7. Hämatoxylin-Färbung
      1. 5-8 Min. in Hämatoxylin färben. Differenzieren Sie in 1% saurem Alkohol (1% HCl in 70% Alkohol) für 5-10 s.
      2. Tauchen Sie die Objektträger 5-10 s lang in destilliertes Wasser. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   8. Austrocknung
      1. Verarbeiten Sie die Objektträger in sequenzieller Reihenfolge durch die Glasschalen: 5 Minuten lang in 75 % Ethanol eintauchen, 5 Minuten lang auf 85 % Ethanol umfüllen, 5 Minuten lang auf 95 % Ethanol umstellen, gefolgt von zwei separaten Eintauchen in 100 % Ethanol für jeweils 10 Minuten und schließlich für zwei aufeinanderfolgende 20-Minuten-Perioden in Xylol legen.
   9. Montage von Schienen
      1. Füge Xylol zu neutralem Kaugummi hinzu, bis es transparent wird. Leicht an der Luft trocknen lassen. Träufeln Sie dann Kaugummi mit Xylol, um den Organoidbereich zu bedecken.
      2. Deckglas auftragen. Scannen und analysieren Sie die Folie.
3. Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbung (mIF)
   1. Für die Entparaffinierung und Hydratation wiederholen Sie Schritt 5.2.1.
   2. Für die Peroxidase-Blockierung ist Schritt 5.2.3 zu wiederholen.
   3. Für die Antigengewinnung ist Schritt 5.2.3 zu wiederholen.
   4. Blockierung von Schafserum.
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.2.4.1. Fügen Sie Schafsserum-Blockierungslösung hinzu, um den Organoidbereich abzudecken. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
      2. 2 Min. in PBST waschen. Zweimal wiederholen.
   5. Für die Inkubation von Primärantikörpern ist Schritt 5.2.4 zu wiederholen.
   6. Für die Inkubation von Sekundärantikörpern ist Schritt 5.2.4.1 zu wiederholen.
      1. Tropfenweise spezifische Sekundärantikörperlösung zur Abdeckung des Organoidbereichs. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie Schritt 5.2.3.2.
         HINWEIS: Schützen Sie die Objektträger in diesem Schritt bis zum Ende des Experiments vor Licht.
   7. Fluoreszierende Farbstofffärbung
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.3.4.1. Lassen Sie die Fluoreszenzfarbstofflösung auffallen, um den Organoidbereich abzudecken.
      2. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur 10-20 min inkubieren. Wiederholen Sie Schritt 5.2.3.2.
   8. Für Mehrfachfärbungen sind die Schritte 5.3.3-5.3.7 zu wiederholen.
   9. DAPI-Färbung
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.2.4.1. Lassen Sie die DAPI-Lösung auf, um den Organoidbereich abzudecken. Wiederholen Sie Schritt 5.2.3.2. Wiederholen Sie anschließend Schritt 5.3.4.2.
      2. Tauchen Sie die Objektträger 2 Minuten lang in sterilisiertes Wasser.
   10. Montage von Schienen
       1. Lassen Sie das Antifading-Eindeckmedium fallen, um den Organoidbereich abzudecken. Deckglas auftragen.
   11. Erfassen Sie digitale Bilder mit einem Diascanner und analysieren Sie diese.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Organoid-Probenahme und die histologische Analyse in verschiedenen Stadien der ESCC-Tumorgenese (Abbildung 1). Durch die Probenahme von normaler Ösophagusschleimhaut, niedriggradigen intraepithelialen Neoplasien (LGIN), hochgradigen intraepithelialen Neoplasien (HGIN) und Tumorgeweben von ESCC-Patienten können Organoide konstruiert werden, die verschiedene Stadien der Tumorgenese repräsentieren. Des Weiteren wurden Paraffin...

Diskussion

Die Etablierung und histologische Analyse von Organoiden stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Modellierung der Tumorprogression dar. Das Protokoll bietet deutliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden zur Untersuchung der Tumorgenese²⁰. Im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Zellkultursystemen behalten Organoide eine komplexe dreidimensionale Architektur und zelluläre Heterogenität bei, die die In-vivo-Bedingungen besser widerspiegeln. Im Vergleic...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck	Cat#SLGPR33RB
24-well plate	Corning	Cat#3524
4% Paraformaldehyde	Beyotime	Cat# P0099
70 μm sterile strainer	Falcon	Cat#352350
A83-01	Tocris Bioscience	Cat# 2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	Cat# 12634028
Agar	Solarbio	Cat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)	Gibco	Cat# 15240062
B-27 supplement	Gibco	Cat# 17504044
CO2 incubator	Thermo	Cat#371GPCN
Collagenase IV	Gibco	Cat# 17104019
Cryostor	STEMCELL	Cat# 07930
DMEM	Corning	Cat# 10-013-CV
EGF	Gibco	Cat# PHG0313
Fetal bovine serum	Cell Technologies	Cat# 30070
G-418	Sigma	Cat# A1720
Gelatin	Solarbio	Cat# G8061
GlutaMAX	Gibco	Cat# 35050061
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	Cat# 354230
HE staining kit	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd	NA
HEPES	Gibco	Cat# 15630080
Histological pen	Zsbio	Cat#ZLI-9305
Hygromycin B	Sigma	Cat# 400050
Immunohistochemical staining kit	ZSGB-BIO	PV-8000
L-WRN	ATCC	CRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 supplement	Gibco	Cat# 17502048
Neutral gum	Zsbio	Cat#ZLI-9555
Opal 5-Color Manual IHC Kit	PANOVUE	Cat# 10144100100
PBS	MeilunBio	Cat#MA0015
Rabbit Monoclone anti-PD-L1	CST	Cat# 13684; RRID:AB_2687655
Rabbit Polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# ab16667; RRID:AB_302459
Rabbit Polyclonal anti-KRT6A	Proteintech	Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Sheep serum	Zsbio	Cat#ZLI-9056
TrypLE Express	Gibco	Cat# 12604021
TrypLE-EDTA	Gibco	Cat#15400-054
Whole slide image scanner	Hamamatsu	Cat#C13210
Y-27632	Selleck Chemicals	Cat# S1049