斑马鱼的响应行为的检测，以测量光强的变化

摘要

我们开发的视觉运动反应，反应轻的递增和递减定量幼虫斑马鱼的电机输出。我们还研究了斑马鱼的视觉突变，包括没有视动反应（NRC）的突变体，它被认为是完全失明的另一个视力检测，视动反射测试时。

摘要

视动反射（OKR）是一个基本的视觉反射展出，大部份脊椎动物和眼视觉场景相对稳定起着重要作用。然而，OKR需要检测的动物移动的条纹，它可能是鱼类，未能表现出一种OKR未必完全失明。斑马鱼突变体，没有视动反应彗星（NRC）在任何光线条件下测试，并报告完全失明没有OKR。此前，我们已经表明，OFF神经节细胞的活性，可在这些突变体的记录。为了确定是否与没有NRC的突变体，如OKR突变鱼可以检测到简单的轻的递增和递减，我们开发的视觉电机行为检测器（VMR）。在这个实验中，单斑马鱼幼虫放置在每个允许同时使用自动视频跟踪系统的幼虫监测的96孔板以及。每个幼虫的30分钟指示灯亮起，指示灯熄灭30分钟的运动反应记录和量化。聚鱼后灯被称为惊跳反应，随后返回到低比基线活动电机活动的一个简短的扣球，被称为冻结。聚鱼也大幅增加他们的自发活动紧随灯光熄灭，只有逐步在几分钟内恢复到基线自发活动。 NRC的突变体的回应同样光聚鱼关，但表现出他们的平均活动为WT鱼相比略有减少。电机响应活动光NRC突变延迟和缓慢。有一个NRC的突变响应缓慢的上升时间，光相比WT光响应。结果表明，NRC鱼是不完全失明。因为硬骨鱼类可以检测到通过非视网膜组织中，我们确认使用chokh（CHK）的突变体，完全没有眼睛，从发展的最初阶段，直接的行为反应的光强度的变化需要的完整的眼睛。在我们的VMR检测，CHK突变体表现出没有惊吓反应，无论是轻或关，表明横向眼睛调解这种行为。 VMR检测形容这里补充行之有效的OKR检测，不测试斑马鱼幼虫的能力以应对光强的变化。此外，VMR检测的自动化，适合于高通量筛选驱动的视觉反应的光强度的缺陷。

研究方案

该协议列出的步骤来执行在自己的实验室光增量和递减的斑马鱼幼虫的视觉运动反应。斑马鱼是一个伟大的行为研究模型系统。他们易于维护，他们有很大的离合器大小，并迅速发展。例如，斑马鱼幼虫的眼睛是顺应轻发展的第3天，在这时候，他们表现出了惊吓反应。

第1部分：电镀成96孔板个别鱼

1. WT幼虫生长在一个黑暗/光周期在28 ° C，直到受精后至少4天（DPF）。我们典型的光：暗周期是14小时的灯光，在上午9:00开始，10小时的灯关闭，下午11:00开始。为了获得最佳的行​​为结果，避免过度拥挤;我们通常不超过50幼虫保持在一个培养皿。
2. 4 DPF后，斑马鱼是准备转移到一个96孔板。为了让更多的幼虫游泳室，我们通常使用一个96孔板，650μL以及大小与大，但是，标准的96孔板的工作只是罚款。使用的塑料转让吸管，轻轻地转移每幼虫。
3. 转移入井的鱼后，填写水面近冲洗井的顶部有足够的鱼水之每口井。溢出或底部填充的以及可能会导致录制相机的光学问题。此外，小心不要引入气泡入井。

第2部分：调查的录音装置

对于这个协议的一部分，请参考电影识别组件，并熟悉我们设置录音装置自己。

1. 录音室里面是一个定义良好的位置的96孔板。
2. 相机是定位在后面，重点是对使用过的框镜板。这些反射镜的角度可以调整，通过旋转螺丝固定到位的镜子。
3. 录音室是从底部通过红外发光二极管照亮。这使得相机即使在黑暗中看到的鱼。幼虫无法检测到红外光，所以这个常数的红外照明，不影响实验。白光LED，也照亮从下面的录音室。他们分别从红外灯控制。照明的白光从上面或从侧面室当然是可能的，然而，在这些情况下，必须采取离水面，可能会干扰相机，避免强烈刺眼。
4. 对于实验，超过几个小时，填室轻轻运行的水，以帮助保持恒温实验的持续时间。完成的水不断流的一种方法是由一个小型的水族馆泵，是一个典型的水下水族馆加热器加热至28 °的水从水库泵。
5. 为了尽量减少杂散振动从房间，整个录音单位应当搭起一个沉重的余额表。

第3部分：与电脑的视频跟踪电网的96孔板中的对齐方式

软件

1. 将96孔板中含有鱼进录音室。
2. 使用水浴时，慢慢地在水中放置板，水位有机会的情况下调整蔓延到盘子。另外，关闭水流，加板，然后恢复流动。此外，请务必使用一个弹簧或橡皮筋​​固定到位96孔板。
3. 的观点Videotrack软件，检查您的实验，所有的幼虫在电脑屏幕上是可见的。使用该软件的控制，配合你的盘子里，这样，每条鱼是在一个正方形网格井，视频跟踪软件的电网。跟踪计算机将计算运动分别为这些框，所以如果你错位的计算机网格，一些鱼的动作可能会丢失。或者更糟糕的是：两个相邻的鱼会占用同一地区，并作为一条鱼算。为您的录音，这一步是非常重要的的。
4. 对齐后，程序应该去当灯光开启和关闭的时间。我们通常允许3个小时的浅色或深色的包装盒中的适应，既要获得一个基线活动水平，但也给幼虫有机会冷静下来以下的移液器和处理。基线后，我们再备用开​​灯关灯30分钟与30分钟，并重复数次。
5. 下一步，关闭录音室的门，并开始录制。
6. 在实践中，我们记录每个每秒鱼的活动，但实际上视点软件记录帧数据的帧（指电影数据收集示范）。设置每帧的最小像素变化的阈值将一定程度上取决于您的特定的摄像头和光线设置。我们的设置，我们通常使用的4个像素的门槛，也就是说，如果少于4个像素发生变化，它被认为是背景。如果超过4个像素的移动，则表示鱼是移动。我们凭经验确定，截止检测几乎所有的幼虫游泳和转身动作。
7. 即使录音盒隔离幼虫相当不错，关闭在房间里的光线和照顾，以尽量减少机械噪声，例如关闭和打开房间的门，有一个舞会，或做你的锻炼例程中断。

第4部分：数据分析

1. 实验完成后，转移到一个Excel工作表或到您最喜爱的分析套件收集的数据。
2. 所附的Excel工作表是一个什么样的数据可能看起来像的例子：它包含在几秒钟内从每人幼虫秒，所有的鱼在整个实验的实验和活动的开始时间（见补充文件的示例数据文件的节本页面）。
   
   
3. 图1显示了一个单一的幼虫活动的一个例子。图2是一个代表40 WT斑马鱼幼虫的平均跟踪。平均和关闭的反应是突出和一致的。
   
   
   
   图1：5 DPF一个单一的聚鱼一条鱼的活动在光周期的30分钟交替的ON和OFF 活动 。对反应表示黑色箭头和红色箭头OFF反应。
   
   
   
   图2：40鱼的平均活动40 5 DPF WT鱼在光周期的30分钟交替的ON和OFF平均活动 。平均（黑色箭头）和OFF（红色箭头）的反应是突出和一致的。

5。代表性的成果

图3是一个我们所有的实验中所用的实验大纲的原理轮廓。



图3。实验设计的视觉运动反应器（VMR）测试。）鱼被放置在一个96孔板，在录音室。每条鱼的活动，是衡量每秒。 B）鱼都获得了或深或浅的适应期，解决他们获得基线活动水平。期间关闭30分钟的灯和灯光是连续推出了3个小时的总。此图是改编自探针等，2006年。

视觉运动反应图什么样子呢？

我们测得的聚鱼灯的递增和递减的ON和OFF反应。为了证实这些反应依赖于眼功能，我们测量CHK突变体的活动，不发展任何眼睛。图4显示了从野生型动物以及CHK突变体获得的平均活动。



图4：WT鱼有明确的ON和OFF斑马鱼幼虫在5 DPF光对30分钟和30分钟的灯熄灭的运动行为是由眼睛的外侧介导的反应是每秒记录。每个跟踪代表平均480从120个人WT（蓝色线）或CHK突变的幼虫（橙色线）录得超过3实验的反应。 CHK突变体没有显着增加他们的活动，无论是轻的递增或递减，有一个活动的基线水平低。改编自Emran等人，2007年这个数字。

从NRC突变鱼的视觉运动反应。

NRC的突变被认为是完全失明OKR测试的基础上。 NRC的突变体，感光终端不正确形式和视觉通路上却是^大打折扣 1 。从这些突变鱼视网膜神经节细胞的录音显示，他们表现出断型神经节细胞的反应，一些异常的ON - OFF，但没有纯粹^的 2型反应为主。

我们使用VMR测试表明，NRC突变正常关闭响应延迟和缓慢的响应（ SEE图5）。因此，NRC的突变并非完全失明以前认为的^2。


图5：NRC mutats在光照强度的变化增加其活动的行为反应，指示灯亮起，WT 和 NRC突变幼虫在5 DPF 。每个跟踪代表平均480 120名来自各基因型的个体鱼的反应。 NRC突变体的平均运动器官的行为（粉红色的痕迹）相比，聚鱼（蓝色的痕迹）略有减少，但仍然旺盛关刺激。注意在NRC突变响应缓慢的上升时间亮起比较轻的WT鱼响应。

讨论

我们在影片中展示的实验程序是代表所有的WT鱼。然而，这些实验可以做类似于突变鱼（见代表结果部分）。我们建议板聚鱼和在棋盘大纲为最优控制的目的相同板上的突变鱼。

当使用相同的板聚鱼突变的鱼，确保您写下什么类型的鱼，每孔镀。这里有一个如何保持鱼镀在每口井的轨道（显示数据表的注意书）的建议。

另外，最好在一天的同一时间做了一定的实验重复。例如，如果你开始的3个小时的...

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences