Поведенческие Пробирной для измерения Отзывчивость данио рерио на изменения в интенсивности света

Резюме

Мы разработали Visual-двигательную реакцию для количественного мощность двигателя личинок полосатого данио в ответ на свет и уменьшает шагом. Мы также рассмотрели данио видение мутантов, в том числе не optokinetic ответа (СРН) мутантов, которые, как считалось, чтобы быть полностью слепым при испытаниях, другое видение, анализ, optokinetic рефлекс.

Аннотация

Optokinetic рефлекса (ОКР) является одним из основных визуальных рефлекс выставлены большинства позвоночных и играет важную роль в стабилизации глаз по отношению к визуальной сцены. Тем не менее, ОКР требует, чтобы животное обнаружения движущихся полос и не исключено, что рыбы, которые не в состоянии проявлять ОКР не может быть полностью слепым. Один данио мутант, не optokinetic ответ с (СРН) не имеет ОКР при любых условиях освещенности проверены и, как сообщается, полностью слепым. Ранее мы показали, что OFF-ганглия активность клеток могут быть записаны в этих мутантов. Чтобы определить, мутант рыба с ОКР не такие, как СРН мутант может обнаружить простым шагом свет и уменьшает мы разработали визуальные двигателя поведенческих анализа (VMR). В данном анализе одной личинки данио помещаются в каждую лунку 96-луночного планшета позволяет одновременное наблюдение личинок использованием автоматизированных видео-системы слежения. Опорно-двигательного ответов каждой личинки до 30 минут свет и 30 минут выключенным освещением были записаны и количественно. WT рыбы короткое время подскочили двигательной активности на свет, известный как старт-рефлекс, а затем вернуться к более низкие, чем базовый деятельности, называется замерзнуть. WT рыбы также резко увеличить свою двигательную активность сразу же после выключенным светом и лишь постепенно (в течение нескольких минут) возвращение к исходному двигательной активности. СРН мутантов реагировать так же, как освещение выключено WT рыбы, но выставлять небольшое снижение их средней активности по сравнению с WT рыбы. Двигательная активность в ответ на свет в СРН мутантов задерживается и вяло. Существует медленного нарастания ответ СРН мутант с включенным освещением по сравнению с WT свет на реакцию. Результаты показывают, что СРН рыбы не полностью слеп. Потому что костистых рыб можно обнаружить свет через не-сетчатки тканей, мы подтвердили, что немедленное поведенческих реакций на свет интенсивности изменения требуют нетронутыми глаз с помощью Чох (ЧК) мутантов, которые полностью лишены глаз от ранних стадиях развития. В нашем анализе VMR, CHK мутанты не проявляют испуга ответа ни свет или выключается, показывая, что боковыми отверстиями посредником этого поведения. Анализ VMR описанные здесь дополняет устоявшихся ОКР анализа, который не испытывает способности данио личинки реагировать на изменения в интенсивности света. Кроме того, автоматизация анализа VMR поддается высокопроизводительного скрининга на наличие дефектов в интенсивности света приводом визуальные ответы.

протокол

Этот протокол описывает шаги для выполнения зрительно-моторной Ответ данио личинок на свет и уменьшает шагом в вашей собственной лаборатории. Данио рерио являются отличным модельной системой для изучения поведения. Они просты в обслуживании, они имеют большие размеры сцепления, и они быстро развиваются. Например, глаза личинки данио реагируют на свет 3-й день развития и в какое время они показывают старт-рефлекс.

Часть 1: Покрытие отдельных рыб в 96 ячейках

1. Расти WT личинки под темный / светлый цикл при 28 ° C по крайней мере до 4 дня после оплодотворения (DPF). Наш типичный свет: темно цикл составляет 14 часов свет, начиная с 9:00, и 10 часов выключенным светом, начиная с 11:00 вечера. Для лучшего поведенческих результатов, избежать переполненности, мы как правило, держать не более 50 личинок в одной чашке Петри.
2. После 4 денье, данио готовы для передачи в 96-луночного планшета. Чтобы дать более личинки плавание комнате, мы обычно используем 96-луночного планшета с большими хорошо размере 650 мкл, однако, стандартный 96-луночных работать нормально. Использование пластиковой пипетки передачу, плавно перевести одну личинку на лунку.
3. После передачи рыбу в колодцах, заполнить каждую лунку с достаточным количеством воды рыб, таких, что поверхность воды почти вровень с верхней части скважины. Либо переполнения или underfilling также может вызвать проблемы для оптических записи камеры. Кроме того, позаботьтесь, чтобы не вводить пузырей в скважинах.

Часть 2: Обзор регистрирующей аппаратуры

Для этой части протокола можно найти в фильме для идентификации компонентов, а также ознакомиться с нашими настройка регистрирующей аппаратуры.

1. Внутри записи камеры четко определены места для размещения 96-луночного планшета.
2. Камера расположена на задней и ориентирована на пластине с помощью зеркал от коробки. Угол этих зеркал можно регулировать путем поворота винта, которые держат зеркала на месте.
3. Запись камеры освещается снизу инфракрасными светодиодами. Это позволяет камере видеть рыбу даже в темное время суток. Личинки не могут обнаружить ИК-света, так это постоянное ИК-подсветки не влияет на эксперимент. Белые светодиоды освещают также запись камеры снизу. Они управляются отдельно от ИК-света. Освещение камеры с белым светом сверху или с боков, конечно, возможно, однако в этих случаях необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать сильных бликов от поверхности воды, которые могут помешать камере.
4. Для экспериментов, которые длятся дольше, чем пару часов, заполнить камеры с аккуратно проточной водой для поддержания постоянной температуры для экспериментальных продолжительности. Один из способов достижения постоянного потока воды для перекачки воды из резервуара на небольшой насос аквариум, который нагревается до 28 ° с типичными подводных нагреватель аквариума.
5. Чтобы свести к минимуму паразитные вибрации от комнаты, весь блок записи должны сидеть на вершине тяжелый стол баланса.

Часть 3: Согласование 96-луночного планшета с компьютером сетке видео-слежения

Программное обеспечение

1. Место 96-луночного планшета содержащих рыбу в записи камеры.
2. При использовании водяной бане, медленно место пластины в воду, что дает уровень воды возможность регулировать, не проливая на тарелку. Кроме того, отключение воды, добавить пластину, а затем возобновить поток. Кроме того, не забудьте использовать весной или резинкой, чтобы провести 96-луночного планшета на месте.
3. В программное обеспечение Videotrack Точка зрения, проверьте, что все личинки эксперимента видны на экране компьютера. Использование элементов управления программным обеспечением, выровнять сетку видео-слежения программное обеспечение с скважинах вашей тарелке так, что каждая рыба находится в пределах квадрата сетки. Отслеживание компьютер будет расчете движения отдельно для каждой из этих коробок, так что если вы сместить компьютера сетке некоторые из рыбы движения могут быть потеряны. Или еще хуже: два смежных рыба будет занимать такую ​​же площадь и засчитывается как одна рыба. Этот шаг очень важен для всех ваших записей.
4. После выравнивания, программа сроках, когда огни должны идти и выключать. Как правило, мы за 3 часа светлые или темные адаптации в окно как для получения базового уровня активности, но и дать личинки возможность успокоиться после пипетки и управляемости. После базового уровня, мы тогда чередуются с 30 минут свет, затем 30 минут выключенным светом, и повторить несколько раз.
5. Затем закройте дверь записи камеры и начать запись.
6. На практике, мы записываем деятельности каждой рыбы в секунду, но точка зрения программного обеспечения на самом деле записи кадра данных (см. фильмдля демонстрации сбора данных). Установка порогового значения для минимального изменения пикселей в кадре будет зависеть несколько на вашей конкретной камеры и легкой установки. В нашей ситуации мы обычно используем порог 4 пикселя, то есть, если менее 4 пикселя меняется, то считается фоном. Если более 4 пикселей движутся, это означает, рыба движется. Мы эмпирически установлено, что эта отсечка обнаруживает почти все личиночные плавать и превратить движений.
7. Хотя записи коробки изолировать личинки довольно хорошо, выключите свет в комнате и заботиться, чтобы минимизировать перебои с механических шумов, таких как закрытие и открытие двери в комнату, имеющих танцевальную вечеринку, или делать свою процедуры упражнения.

Часть 4: Анализ данных

1. После эксперимент завершен, передача данных, собранных в лист Excel или в ваш любимый пакет анализа.
2. Прилагаемый лист в Excel является примером того, что данные могут выглядеть следующим образом: она содержит время в секундах от начала эксперимента и деятельности каждого личинки в секунду для всех рыб на протяжении всего эксперимента (см. дополнительный файл данных Пример в Файлы разделе этой странице).
   
   
3. На рисунке 1 показан пример деятельности одной личинки. Рисунок 2 является представителем след в среднем на 40 личинки данио WT. Усредненные ВКЛ и ВЫКЛ ответы видным и последовательным.
   
   
   
   Рисунок 1: Деятельность одной рыбы деятельности одного WT рыбы в 5 денье в ответ на чередование периодов по 30 минут свет ВКЛ и ВЫКЛ.. По отзывам, обозначены черными стрелками и OFF ответы с красными стрелками.
   
   
   
   Рисунок 2: Средняя активность 40 рыб средняя активность 40 WT рыбы в 5 денье в ответ на чередование периодов по 30 минут свет ВКЛ и ВЫКЛ.. Усредненные ON (черные стрелки) и OFF (красные стрелки) ответы видным и последовательным.

5. Представитель Результаты

На рисунке 3 схематическом плане экспериментальной схема используется во всех наших экспериментов.



Рисунок 3. Экспериментальный дизайн Визуальный двигательную реакцию (VMR) тест.) Индивидуальные рыбы находятся в 96-луночного планшета в записи камеры. Деятельность каждой рыбы измеряется в секунду. B) Рыба даны период темного или светлого адаптации к их урегулированию и получить исходный уровень активности. Периоды 30 минут свет и огни OFF вводятся последовательно в общей сложности 3 часа. Эта схема была заимствована из Пробер и соавт., 2006.

Как зрительно-моторной графы Ответ выглядит?

Мы измерили ВКЛ и ВЫКЛ ответы WT рыб на свет и уменьшает шагом. Чтобы подтвердить, что эти ответы были зависимы от глаз функции, мы измерили активность мутантов ЧК, которая не развивается никаких глаз. Рисунок 4 показывает средний деятельности, полученные от WT животных, а также CHK мутантов.



Рисунок 4: WT рыбы ясно ВКЛ и ВЫКЛ ответы, которые опосредованы боковыми отверстиями опорно-двигательного поведения данио личинки в 5 денье в ответ на 30 минут свет на 30 минут света OFF записывается в секунду.. Каждая кривая представляет среднем 480 ответов от 120 индивидуальных WT (синяя линия) или CHK мутант личинки (оранжевая линия) зарегистрировано более 3 экспериментов. CHK мутанты не значительно увеличить их деятельности либо свет увеличивает или уменьшает и имеют низкий уровень базовой деятельности. Эта цифра была адаптирована из Emran и соавт., 2007.

Визуально-двигательных реакций от рыбы СРН мутанта.

СРН мутант считалось, что полностью основано на слепой тест ОКР. В СРН мутанта, фоторецептор терминалов не являются должным образом и на зрительного пути серьезно скомпрометирована ^1. Ганглиозных клеток сетчатки записи из этих мутантов рыбы показало, что они демонстрируют преимущественно OFF-типа ганглиозных клеток ответов, некоторые ненормальные ON-OFF, но не чистый С-типа ответов ^2.

Использование VMR теста мы показали, что СРН мутант имеет нормальный OFF-ответ и задержки и вялой ON-ответ (SEэлектронной рис. 5). Таким образом, НРК мутант не полностью слеп, как считалось ранее ^2.


Рисунок 5: СРН mutats повышение их активности в ответ на изменения интенсивности света поведенческие реакции на свет и выключается из WT и СРН мутант личинки в 5 денье.. Каждая кривая представляет среднем 480 ответов из 120 отдельных рыб друг от генотипа. Среднее поведение опорно-двигательного мутантов СРН (розовый следы) немного снижается по сравнению с WT рыбы (синий следы), но остается энергичным следующие выключенным освещением стимул. Обратите внимание на медленное время рост ответ СРН мутант с включенным освещением по сравнению с включенным освещением реакция WT рыбы.

Обсуждение

Экспериментальных процедур мы показываем в фильме все представитель WT рыбы. Однако, эти эксперименты можно сделать аналогично на мутанта рыбы, а (см. раздел представитель результат). Мы предлагаем пластины WT рыбы и мутантных рыб на одной тарелке в план проверки платы для целей оптимального контро?...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences