光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

要約

我々は光をインクリメントおよびデクリメントに対応して幼虫のゼブラフィッシュのモータ出力を定量化するために視覚運動応答を開発した。我々はまた別のビジョンアッセイ、視覚性運動反射によってテストするときに完全に盲目であると思われた視運動性応答（NRC）変異体、何を含めていないゼブラフィッシュのビジョンの変異を調べた。

要約

視覚性運動反射（OKR）は、基本的な視覚的な反射がほとんどの脊椎動物で展示し、ビジュアルシーンの相対目を安定させる上で重要な役割を果たしています。しかし、OKRは動物が移動するストライプを検出する必要があります、それはOKRを示すために失敗した魚は完全に盲目ではないかもしれないという可能性があります。一つのゼブラフィッシュ変異体では、ない視運動性応答C（NRC）は、どんな光の条件下ではOKRはテストされていないので、完全に盲目であることが報告された。以前は、我々は、OFF -神経節細胞の活動がこれらの変異体に記録されることが示されている。このようなNRC変異体のような無OKR持つ変異体の魚たちは視覚的な運動行動試験（VMR）を開発したシンプルな光のインクリメントとデクリメントを検出できるかどうかを判断する。このアッセイでは、単一のゼブラフィッシュの幼虫は、自動化されたビデオトラッキングシステムを使用して幼虫の同時モニタリングを可能にする96ウェルプレートの各ウェルに配置されます。ライトON、30分および30分の光をOFFに各幼虫の運動応答を記録し、定量した。 WTの魚は、下げるよりも、ベースラインの活動復帰が続く驚愕反応として知られているONライト、、時のモータ動作の短いスパイクを持って凍結と呼ばれる。 WTの魚は（数分以上）ベースラインの自発運動への復帰をも大幅に照明をOFFにした直後に、その運動活性を増加させ、徐々にしか。 NRCの変異体はWT魚として消えていると同じように応答しますが、WT魚と比較してそれらの平均の活性のわずかな減少を示す。 NRC変異体ではON光に反応して運動能力が遅れ、低迷しています。応答にWT光と比較してのライトにNRC変異体の応答の遅い立ち上がり時間があります。結果は、NRCの魚は完全に盲目ではないことを示している。硬骨は非網膜組織を介して光を検出できるため、我々は、光強度の変化への迅速な行動反応が完全に開発の初期段階から目を欠くchokh（CHK）変異体を、使用して無傷の目を必要とすることを確認した。私たちのVMRのアッセイでは、CHKの変異体は、横方向の目はこの動作を仲介することを示す、ONまたはOFFの光のどちらにも驚愕反応を示さない。 VMRアッセイは、ここで説明する光強度の変化に対応するためにゼブラフィッシュ幼生の能力をテストしていない十分に確立されたOKRアッセイを、補完する。また、VMRアッセイの自動化は、視覚的な反応を駆動する光の強度の欠陥のためのハイスループットスクリーニングに適しています。

プロトコル

このプロトコルは、独自のラボでの光のインクリメントとデクリメントのゼブラフィッシュ幼生の視覚 - 運動反応を実行する手順を説明します。ゼブラフィッシュは、行動研究のための優れたモデルシステムである。彼らは保守が容易である、彼らは大規模なクラッチサイズを持っている、と彼らはすぐに開発する。例えば、ゼブラフィッシュ幼生の目は、開発の3日目で、彼らは驚愕反応を示すその時の光に敏感です。

第1部：96ウェルプレートにメッキ個々の魚

1. 28で明/暗サイクル下でWT幼虫を育てる℃で少なくとも4日後に受精（DPF）になるまで。私たちの典型的なライト：暗サイクルは午前9時に開始し、そしてライトの10時間OFF、午後11:00に開始のライトの14時間です。最良の行動の結果を得るには、過密を避ける、我々は通常、単一のペトリ皿に50以上の幼虫を保つ。
2. 4 DPF後は、ゼブラフィッシュは、96ウェルプレートに転送する準備が整いました。幼虫より水泳の部屋を与えるために、我々は一般的に650μlの大型よくサイズを96ウェルプレートを使用しますが、標準的な96ウェルプレートは問題なく動作。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、静かによくごとに幼虫を移す。
3. ウェルに魚を転送した後、水の表面が井戸の上にほぼ平らになるように十分な魚の水を各ウェルに必要事項を記入してください。どちらもがあふれたり、アンダーフィルとの録音のカメラ用の光学問題を引き起こす可能性があります。また、ウェルに気泡を導入しないように注意してください。

パート2：記録装置の調査

プロトコルのこの部分については、コンポーネントを識別するためにフィルムを参照し、記録装置の私達の一連の設定をよく理解してください。

1. 内側に録音室には96ウェルプレートの位置を明確に定義された場所です。
2. カメラは背面に配置され、ボックスをオフにミラーを使用してプレートに焦点を当てています。これらのミラーの角度を所定の位置にミラーを保持するネジを回せば調整できます。
3. 記録室は、赤外線LEDで下から照らされている。これは、カメラが暗い場所でも魚を見ることができます。幼虫は赤外光を検出できないので、この定数IRの照明は、実験には影響しません。白色LEDは、下から録音室を照らす。彼らは、赤外光とは別に制御されます。上記または側面からの白色光とチャンバーを照らすことは確かに可能ですが、その場合には、注意が強いが、カメラを妨げる可能性が水面からglares避けるように注意する必要があります。
4. 数時間以上続くその実験のために、優しく、実験期間中、一定温度を維持するために流水でチャンバーを埋める。水の一定流量を達成する1つの方法は、典型的な水中水槽のヒーターで28℃に加熱され、小さな水槽のポンプでタンクから水をポンプすることです。
5. 部屋からの浮遊振動を最小限に抑えるために、全体の記録装置は、重いバランステーブルの上に座っているはず。

パート3：ビデオ追跡のコンピュータのグリッドと96ウェルプレートのアライメント

ソフトウェア

1. 録音室に魚を含む96ウェルプレートを置きます。
2. 水浴を使用する場合は、徐々に水位をプレートの上にこぼれることなく調整するチャンスを与えて、水でプレートを置きます。また、水の流れを遮断する板を追加して、フローを再開する。また、場所に96ウェルプレートを保持するためにバネやゴムバンドを使用してください。
3. 視点Videotrackソフトウェアでは、あなたの実験のすべての幼虫が、コンピュータの画面上に表示されることを確認してください。ソフトウェアのコントロールを使用して、それぞれの魚がグリッドの正方形内になるようにしてプレートのウェルにビデオトラッキングソフトのグリッドに合わせます。トラッキングコンピュータは、コンピュータのグリッドがずれそうであれば、魚の動きの一部が失われる可能性があります、これらのボックスのそれぞれに別々の動きを計算されます。またはさらに悪い：2つの隣接する魚は、同じ領域を占有され、1魚としてカウントされる。このステップでは、すべてのレコーディングのために非常に重要です。
4. 整列後、プログラムライトがオンとオフに行く必要があるときのタイミング。我々は通常、ボックス内の光や暗順応の3時間がベースラインの活動レベルを得るためだけでなく、幼虫のピペット操作や取り扱いは、次の沈静化する機会を与えるために、両方が可能。ベースラインの後、我々のランプの30分で、代替は、ライトの30分でOFFに続いて、と数回繰り返す。
5. 次に、録音室のドアを閉じ、記録を開始します。
6. （フィルムを参照して実際には、我々は、1秒当たりの各魚の活動を記録、しかし実際には視点のソフトウェアは、フレームデータがフレームを記録するデータ収集のデモンストレーションのため）。フレームあたりの最小ピクセルの変化のしきい値を設定すると、特定のカメラとライトの設定に多少左右されます。我々のセットアップのために、我々は通常、4ピクセルのしきい値を使用して、つまり、より少ない4ピクセルが変化している場合、それが背景とみなされます。以上の4ピクセルが移動している場合、それは魚が動いていることを示します。我々は経験的にこのカットは、ほとんどすべての幼虫の水泳やターンの動きを検出することを決定。
7. 録音ボックスはかなりよく幼虫を分離するにもかかわらず、部屋に光をオフにして、閉じるなどして開くドアを部屋で、ダンスパーティーを持っている、またはあなたのエクササイズを行うなど、機械的なノイズと中断を最小限にするように注意してください。

パート4：データの分析

1. 実験が完了すると、Excelシートにまたはあなたの好みの分析スイートに収集されたデータを転送する。
2. 添付のExcelシートは、データがどのようになるかの例です：それは、実験全体を通して、すべての魚のための秒あたりの各幼生の実験や活動の開始からの時間を秒単位（で補足ファイルのサンプルデータを参照して含まれていますこのページのファイル]セクション）。
   
   
3. 図1は、単一の幼虫の活動の例を示しています。図2は、40重量ゼブラフィッシュの幼虫の平均の代表的なトレースです。で平均化し、OFF応答が顕著と一致している。
   
   
   
   図1：単一の魚の活性のONとOFFを光で30分の交互の期間に対応する5 DPFでの単一WT魚の活動。。応答にある黒い矢印と赤矢印とOFF応答で示されます。
   
   
   
   図2：40尾の平均活動のONとOFFを光で30分の交互の期間に対応する5 DPFで40 WT魚の平均活動。。で平均化（黒矢印）とOFF（赤矢印）の応答が顕著と一致している。

5。代表的な結果

図3は、我々の実験のすべてで使用されている実験的な輪郭の概略図概略です。



図3。視覚運動反応（VMR）試験の実験的なデザイン。）個々の魚は、録音室で96ウェルプレートに配置されます。それぞれの魚の活性は、毎秒測定されます。 B）魚は、それらを解決するために、ベースラインの活動レベルを得るために暗または明順応の期間を与えられている。 ONとOFFの点灯30分ライトの期間は、3時間の合計のために連続して導入されています。この図は、プローバら、2006から翻案されました。

視覚運動応答のグラフは、どのようなものでしょうか？

我々は、光のインクリメントとデクリメントのWT魚のONとOFFの応答を測定した。これらの応答は、眼の機能に依存していたことを確認するために、我々はどんな目を発症しないCHK変異体の活性を測定した。図4は、WT、動物だけでなく、CHKの変異体から得られた平均的な活動を示しています。



図4：。WT魚は、横方向の目によって媒介される応答のONとOFFを明確に持つ 5 DPFにおけるゼブラフィッシュ幼生の運動行動の光の30分ONと光のOFFの30分への応答では毎秒記録されます。各トレースは、120個々のWT（青のトレース）または3つの実験にわたって記録されたCHK変異体の幼虫（オレンジ色のトレース）から480応答の平均を表しています。 CHKの変異は著しく、光増分または減分のどちらかにその活性を高め、活動の低いベースラインのレベルを持っていない。この図は、Emranら、2007年から適応されました。

NRC変異魚から視覚運動応答 。

NRC変異体は、OKRのテストに基づいて完全にブラインドと考えられていた。 NRC変異体では、光受容体端末が正しく形成されず、視覚的な経路上で深刻な^1を危険にさらされます。これらの変異魚から網膜神経節細胞のレコーディングは、彼らは主にOFF型神経節細胞応答、何らかの異常なON - OFFが^、2オンタイプの応答がない純粋を示すことを明らかにした。

VMRのテストを使用して、我々はNRC変異体は、通常のオフ応答と遅延と低迷ON -応答を有することを示した（SEeは、図5）。従って、NRC変異体は、以前に考えられていた²のような全盲ではない。


図5：NRCのmutatsは光強度の変化に応じてその活性を増加させる行動反応はWTと5 DPFにおけるNRC変異幼虫からの光とOFFする。。各トレースは、各遺伝子型から120個々の魚から480応答の平均を表しています。 NRCの変異体の平均的な運動挙動（ピンクのトレースは）若干としてWT魚（青のトレース）に比べて減少したが、刺激OFF光に続く活発なままです。 WT魚の応答に光に比べてに光にNRC変異体の応答の遅い立ち上がり時間に注意してください。

ディスカッション

我々は映画の中で示す実験手順はWT魚のすべての代表的なものである。しかし、これらの実験は、（代表的な結果のセクションを参照）だけでなく、変異体の魚で同様に行うことができます。我々は、最適制御の目的のためにチェッカーボードのアウトラインで、同じプレート上にプレートWTの魚や変異体の魚に示唆している。

WTの魚と同じプレート上に変異魚を使用する際に魚の種類は、各ウェルに?...

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences