라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

요약

우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

초록

optokinetic 반사 (OKR)는 기본적인 시각 반사 대부분의 척추 동물에 의해 전시 및 영상 장면에 상대적으로 눈에 안정화에 중요한 역할을합니다. 그러나, OKR는 동물 이동 줄무늬를 감지해야하며 그것은 OKR을 전시하지 않는 물고기가 완전히 장님이되지 않을 수도 있습니다. 하나의 돌연변이 zebrafish, 노 optokinetic 응답 C (NRC)는 어떤 조명 조건 테스트 상당히 운이 좋았다고보고했습니다 아래에는 OKR이 없습니다. 이전, 우리는 OFF - 신경절 세포 활동이 돌연변이에 기록될 수 것으로 나타났습니다. 같은 NRC 돌연변이로 노 OKR와 돌연변이 물고기가 간단한 조명 증가 그리고 우리가 시각 모터 행동 분석 (VMR)를 개발 감소를 검색할 수 있는지 여부를 확인합니다. 이 분석에서는 단일 zebrafish의 애벌레는 자동으로 비디오 추적 시스템을 사용하여 유충의 동시 모니터링을 허용하는 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 배치됩니다. 빛 30 분 30 분 가벼운 OFF 각 유충의 전위의 반응은 기록하고 계량했다. WT 생선은 낮은보다 기본 활동을 반환 다음 놀라게 반응으로 알려진 불을,시 모터 활동의 간단한 증가를 동결했다. WT의 물고기 (몇 분 이상) 기준 전위의 활동에 수익을 또한 급격하게 조명을 OFF 다음 즉시 전위의 활동을 증가만을 점차. NRC의 돌연변이 WT 물고기 OFF 가벼운 비슷하게 반응하지만, WT 물고기에 비해 자신의 평균 활동에 약간의 감소를 나타냅니다. NRC 돌연변에서 빛에 대한 응답으로 모터 활동이 지연하고 둔한입니다. 로 반응 WT 조명에 비해 수월하기 위해 NRC 돌연변이의 응답 속도가 느린 상승 시간이 있습니다. 결과는 NRC 물고기 완전히 맹인 아니라는 것을 나타냅니다. teleosts가 아닌 망막 조직을 통해 빛을 감지할 수 있기 때문에, 우리는 가벼운 강도의 변화에​​ 즉각적인 행동 반응이 완전히 개발의 초기 단계에서 눈을 부족 chokh (체크해봐) 돌연변를 사용하여 그대로 눈을 필요는 것을 확인. 우리 VMR의 분석에서 확인해의 돌연변이 측면 눈이 문제를 중재 것을 보여주는 하나 ON 빛 또는 OFF로 더 놀라게 응답을 전시하지 않습니다. VMR의 분석 여기 빛의 농도의 변화에​​ 대응하는 zebrafish 애벌레의 능력을 테스트하지 않습니다 잘 설립 OKR 분석을 보완 설명했다. 또한 VMR 분석의 자동화 시각적 반응을 중심 가벼운 강도의 결함에 대한 높은 처리량 검사라는 것으로.

프로토콜

이 프로토콜은 자신의 실험실에서 빛의 단위 및 감소에 zebrafish 애벌레의 Visual 모터 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. Zebrafish 행동 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 유지하기 쉬운, 그들은 대형 클러치 크기를 가지고 있고, 그들은 신속하게 개발할 수 있습니다. 예를 들어, zebrafish 애벌레의 눈을 개발의 일 3 그들이 놀라게 응답을 전시하는 동시에 빛에 반응하고 있습니다.

1 부 : 96 잘 접시에 각각의 물고기를 도금

1. 28 어두운 / 라이트 사이클에 따라 WT 애벌레의 성장 ° C 이상의 4 일 게시물 수정 (DPF)까지. 우리의 일반 조명 : 어두운주기 오전 9 시에 시작하고, 조명 10 시간 OFF, 11:00 PM에 시작 불을 14 시간입니다. 최상의 행동의 결과를 얻으려면, 인구 과잉되지 않도록, 우리는 일반적으로 하나의 배양 접시에있는 더 이상 50 이상의 유충을 유지.
2. 4 DPF 후, zebrafish는 96 - 웰 플레이트에 전송할 준비가 된 것입니다. 애벌레 더 수영 공간을 제공하기 위해, 우리는 일반적으로 650 μl의 큰 잘 크기가 96 - 웰 플레이트를 사용하지만, 표준 96 - 웰 플레이트가 잘 작동합니다. 플라스틱 전송 pipet을 사용하여 부드럽게 당들이 한 유충을 전송하기만하면됩니다.
3. 우물에 물고기를 전송 후, 수면이 우물의 상단에 거의 플러시는 그러한 정도로 물고기 물 각 우물을 작성하십시오. 어느 overfilling 또는 잘 underfilling하면 녹음 카메라 광학 문제를 일으킬 수 있습니다. 또한, 우물에 거품을 소개 않도록주의 가져가라.

2 부 : 녹음 장치 조사

프로토콜의이 부분을 들어, 구성 요소를 식별하기 위해 필름을 참조하여 기록 장치의 우리 설정할를 맡은지하시기 바랍니다.

1. 레코딩 챔버 내부 96 - 웰 플레이트를 위치로 잘 정의된 장소입니다.
2. 카메라 뒤쪽에 위치하고있는 상자에서 거울을 사용하여 접시에 초점을 맞추고 있습니다. 이 거울의 각도는 장소에 거울을 보유하고있는 나사를 돌려하여 조정할 수 있습니다.
3. 녹음 챔버는 적외선 발광 다이오드 (LED)에 의해 바닥에서 조명합니다. 이것은 카메라도 어둠 속에서 물고기를 볼 수 있습니다. 유충은 IR 조명을 검색할 수 없습니다이 지속적인 IR 조명이 실험에 영향을주지 않도록. 화이트 LED는 아래에서 녹화 실 밝게. 그들은 IR 조명에서 별도로 제어됩니다. 위 또는 측면부터 흰색 빛으로 챔버를 조명하는 것은 확실히 가능하지만, 이러한 경우에주의가 강한가 카메라를 방해할 수있는 물의 표면에 묻은 glares 피하기 위해 이동해야합니다.
4. 몇 시간 이상 지난, 부드럽게 실험 기간 동안 일정한 온도를 유지하기 위해 물을 실행과 챔버를 채우는 것을 실험. 물의 일정한 흐름을 수행하는 한 가지 방법은 전형적인 수중 수족관 히터와 28 °로 가열 작은 수족관 펌프에 의해 저수지에서 물을 펌프하는 것입니다.
5. 객실에서 이탈 진동을 최소화하려면, 전체 기록 장치는 무거운 균형을 테이블 위에 앉아해야합니다.

파트 3 : 비디오 추적의 컴퓨터 그리드와 96 - 웰 플레이트의 정렬

소프트웨어

1. 레코딩 챔버에 물고기가 들어있는 96 - 웰 플레이트를 놓습니다.
2. 물 목욕을 사용할 때, 서서히 수위에게 접시에 흘리고 않고 조정할 수있는 기회를 제공 물에 접시를 놓습니다. 또는, 물의 흐름을 차단 판을 추가하고, 다음 흐름을 재개한다. 또한, 장소에 96 - 웰 플레이트를 잡아 봄이나 고무 밴드를 사용해야합니다.
3. 뷰포인트 Videotrack 소프트웨어, 실험의 모든 애벌레가 컴퓨터 화면에 볼 수 있는지 확인합니다. 소프트웨어의 컨트롤을 사용하여, 각각의 물고기 모양의 격자의 사각형 내에 그러한 접시의 우물과 비디오 추적 소프트웨어의 격자를 맞춥니다. 추적 컴퓨터가 컴퓨터 격자를 misalign면 물고기의 움직임을 일부 손실될 수 있습니다,이 상자의 각 별도로 운동을 계산합니다. 심지어 악화 두 인접한 물고기는 동일한 영역을 차지합니다 한 생선으로 계산됩니다. 이 단계는 모든 레코딩을 위해 매우 중요합니다.
4. 정렬 후, 프로그램 불이 켜거나 가야 때 타이밍. 우리는 일반적으로 상자에 가볍거나 어두운 적응 3 시간 모두 기본 활동 수준을 얻을 수뿐만 아니라 유충에게 pipetting 및 처리 다음과 진정 기회를 제공합니다. 기준 후에, 우리는 다음 OFF 라이트 30 분 뒤에 불을 30 분 대체하고, 여러 번 반복합니다.
5. 다음 레코딩 챔버의 문을 닫고 녹음을 시작합니다.
6. (영화를 참조 실제로, 우리는 초당 각 물고기의 활동을 기록하지만, 실제로 뷰포인트 소프트웨어는 프레임 데이터가 프레임을 기록데이터 수집의 시범을위한). 프레임 당 최소 픽셀 변경에 대한 임계값을 설정하면 특정 카메라와 조명 설정에 다소 달라집니다. 우리의 설치를위한, 우리는 일반적으로 4 픽셀의 임계값을 사용하여, 그 적은 4 개 이상의 픽셀이 변화하는 경우, 그것이 배경 간주됩니다있다. 4 개 이상의 픽셀이 이동하는 경우, 그것은 물고기가 이동을 나타냅니다. 우리는 경험적으로이 단절은 거의 모든 애벌레 수영 및 회전 움직임을 감지 사실을 확인했습니다.
7. 녹음 상자가 상당히 잘 유충을 분리에도 불구하고, 방에 불을 끄고 같은 폐쇄하고 개방 문을 방에, 댄스 파티를 열, 또는 운동 루틴을하고 같은 기계적 노이즈가 방해를 최소화하는데주의를 기울여야.

4 부 : 데이터 분석

1. 실험이 완료되면, 엑셀 시트로하거나 원하는 분석 제품군에 수집된 데이터를 전송합니다.
2. 첨부된 엑셀 시트는 데이터처럼 보일지 모르지만 어떤의 예입니다 : 그것은 전체 실험을 통해 그 동안 맛있는 생선은 초 당 각 유충의 실험과 활동의 시작부터 초 단위로 시간을 (에서 보조 파일 예제 데이터를 참조가 포함되어 있습니다 이 페이지의 파일 섹션).
   
   
3. 그림 1은 단일 유충의 활동의 예를 보여줍니다. 그림 2는 40 WT의 zebrafish의 애벌레의 평균의 대표 성분이다. 은 ON과 OFF 평균 응답은 유수와 일치합니다.
   
   
   
   그림 1 : 단일 물고기의 활동 30 분 빛을 기간을 교류하고 OFF에 대응 5 DPF에서 단일 WT 물고기의 활동.. ON 응답은 검은색 화살표와 빨간색 화살표로 OFF 반응으로 표시됩니다.
   
   
   
   그림 2 : 40 물고기의 평균 활동을 30 분 빛을 기간을 교류하고 OFF에 대응 5 DPF 40 WT 생선의 평균 활동.. 가 ON 평균 (검은 화살표)과 OFF (빨간색 화살표) 반응 유명 일관하고 있습니다.

5. 대표 결과

그림 3은 실험의 모든에 사용되는 실험 개요의 도식 개요입니다.



그림 3. 시각 운동 반응 (VMR) 시험의 실험 설계.) 개인 물고기는 기록 챔버에서 96 - 웰 플레이트에 배치됩니다. 각 물고기의 활동은 초당 측정됩니다. B) 생선은 그들을 해결하고 기본 활동 수준을 얻기 위해 어둡거나 밝은 적응의 기간을 부여하고 있습니다. 30 분 ON 조명과 조명의 기간은 OFF 3 시간 총 연속적으로 소개하고 있습니다. 이 다이어그램 Prober 외에서 맞게되었다., 2006.

비주얼 모터 응답 그래프는 어떤 형태입니까?

우리는 빛의 단위 및 감소에 WT 물고기의 ON과 OFF 반응을 측정. 이러한 반응은 눈 기능에 의존했고 확인하기 위해, 우리는 어떤 눈을 개발하지 확인해의 돌연변이의 활동을 측정. 그림 4는 WT 동물뿐 아니라 확인해의 돌연변이에서 얻은 평균 활동을 보여줍니다.



그림 4 : WT 물고기는 측면 눈을에 의해 중재 아르 답변을 켜거나 취소가 불 30 분 가벼운 OFF 30 분에 대응하여 5 DPF에서 zebrafish 애벌레의 전위의 동작은 초당 기록됩니다.. 각 추적 120 개인 WT (블루 추적) 또는 확인해 돌연변이의 애벌레 (오렌지 추적) 3 실험을 통해 녹화에서 480 응답의 평균을 나타냅니다. 확인해의 돌연변이 크게 증가하거나 감소 빛 중 자신의 활동을 증가하고 활동의 낮은 기본 수준을 필요가 없습니다. 이 수치는 Emran 외., 2007 년부터 조정되었습니다.

NRC 돌연변이 물고기에서 Visual 모터 응답.

NRC 돌연변이 OKR 테스트를 기반으로 상당히 운이 좋았다고 생각했다. NRC 돌연변이에서, photoreceptor 단말기가 제대로 형성하지 않습니다 및 시각 경로에서이 심각하게 ¹ 손실이 크다. 이러한 돌연변이 물고기의 망막 신경절 세포의 녹음들은 주로 OFF 타입의 신경절 세포 응답, 일부 비정상적인 ON - OFF지만, ² 형 반응없이 순수한을 전시하는 것으로 나타났습니다.

VMR 테스트를 사용하여 우리는 NRC 돌연변이가 정상 OFF - 응답 및 지연과 느린 ON - 반응을 가지고 것으로 나타났다 (SEE 그림 5). 따라서 NRC 돌연변이가 이전에 ^생각이 완전히 장님이되지 않습니다.


그림 5 : NRC의 mutats 빛의 농도의 변화에 대응하여 그들의 활동을 증가 행동 응답 WT 5 DPF에서 NRC 돌연변이 애벌레부터 빛과 OFF로.. 각 성분은 각 유전자형 120 개인 생선에서 480 응답의 평균을 나타냅니다. NRC의 돌연변이의 평균 전위의 행동 (분홍색 흔적)은 약간으로 WT 물고기 (블루 성분)에 비해 감소했지만 자극 OFF 빛을 다음 활발한 남아있다. WT 물고기의 반응 조명에 비해 수월하기 위해 NRC 돌연변이 응답의 속도가 느린 상승 시간을 확인합니다.

토론

우리가 영화에서 보여주 실험 절차 WT 생선의 대표입니다. 그러나 이러한 실험은 돌연변이 물고기뿐만 아니라 (대표 결과 섹션을 참조) analogously 할 수 있습니다. 우리는 최적의 제어 목적 검사기 보드 개요에서 같은 접시 플레이트 WT 생선과 돌연변이 물고기로하는 것이 좋습니다.

WT 물고기 같은 접시에 돌연변이 물고기를 사용할 때 당신은 물고기의 종류가 각 우물에 도금 있었는지 적어 있는지 확인하십?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR international	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences