Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

Riepilogo

Abbiamo sviluppato il Visual-Motor risposta per quantificare la potenza del motore di zebrafish larvale in risposta alla luce incrementi e decrementi. Abbiamo anche esaminato visione zebrafish mutanti, tra cui la non optocinetico risposta (NRC) mutanti, che si pensava essere completamente cieco quando testato da un altro saggio di visione, il riflesso optocinetica.

Abstract

Il optocinetico riflesso (okr) è un semplice riflesso visivo esibito dalla maggior parte dei vertebrati e svolge un ruolo importante nello stabilizzare l'occhio rispetto alla scena visiva. Tuttavia, il okr richiede che un animale rilevate delle righe in movimento ed è possibile che i pesci che non riescono a mostrare un okr non può essere completamente cieco. Uno zebrafish mutanti, il no optocinetica risposta c (NRC) non ha okr in qualsiasi condizione di luce testato e stato segnalato per essere completamente cieco. In precedenza, abbiamo dimostrato che OFF-ganglio attività delle cellule possono essere registrati in questi mutanti. Per determinare se il pesce mutante senza okr come il mutante in grado di rilevare incrementi nrc luce semplice e decrementa abbiamo sviluppato l'analisi visiva motore comportamentale (VMR). In questo saggio, le larve di pesce zebra singoli sono posti in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti che consentono il controllo simultaneo di larve utilizzando un sistema automatico di video-tracking system. Le risposte locomotore di ogni larva a 30 minuti di luce ON OFF e 30 minuti di luce sono state registrate e quantificati. Pesce WT hanno un breve picco di attività motoria su luci accese, noto come riflesso di trasalimento, seguito dal ritorno inferiore alle attività di base, chiamato congelare. Pesce WT anche drasticamente aumentare la loro attività locomotoria subito dopo le luci spente e solo gradualmente (nell'arco di diversi minuti) ritorno all'attività di base locomotore. I mutanti NRC rispondono in modo simile alla luce OFF come pesci WT, ma mostrano una leggera riduzione della loro attività media rispetto al pesce WT. Attività motoria in risposta alla luce ON in NRC mutanti è in ritardo e lenta. C'è un tempo di salita lenta della risposta nrc mutante alla luce ON rispetto alla luce WT ON risposta. I risultati indicano che i pesci NRC non sono completamente ciechi. Perché teleostei in grado di rilevare la luce attraverso la non-tessuti della retina, abbiamo confermato che le risposte immediate comportamentali alla luce intensità cambiamenti richiedono occhi intatti utilizzando la (chk) chokh mutanti, che mancano completamente gli occhi fin dai primi stadi dello sviluppo. Nel nostro test VMR, i mutanti chk mostrano alcun risposte di allarme a luce sia ON o OFF, mostrando che gli occhi laterali mediare questo comportamento. Il test VMR descritto qui integra la consolidata okr saggio, che non prova la capacità delle larve di zebrafish per rispondere ai cambiamenti di intensità di luce. Inoltre, l'automazione del test VMR si presta a high-throughput screening per difetti di intensità luminosa guidato risposte visive.

Protocollo

Questo protocollo delinea i passaggi per eseguire il Visual-Motor risposta delle larve di zebrafish per incrementi di luce e decrementi nel vostro laboratorio. Zebrafish è un sistema di grande modello per gli studi comportamentali. Sono facili da mantenere, non hanno dimensioni frizione grande, e si sviluppano rapidamente. Per esempio, gli occhi delle larve di zebrafish sono sensibili alla luce da 3 ° giorno di sviluppo e in quel momento che mostrano una risposte di allarme.

Parte 1: Placcatura singolo pesce in un piatto da 96 pozzetti

1. Crescono le larve WT sotto un ciclo di buio / luce a 28 ° C fino almeno 4 giorni dopo la fecondazione (DPF). La nostra tipica luce: buio ciclo è di 14 ore di luci ON partire alle 9:00, e 10 ore di luci spente, dalle ore 11:00 PM. Per ottenere i migliori risultati comportamentali, evitare il sovraffollamento, noi di solito tenere non più di 50 larve in un piatto unico di Petri.
2. Dopo 4 dpf, il pesce zebra sono pronti per essere trasferiti in una piastra da 96 pozzetti. Per dare più la stanza di nuoto larve, si utilizzano in genere una piastra a 96 pozzetti con un grande e dimensioni di 650 microlitri, tuttavia, standard piastre a 96 pozzetti funzionano bene. Utilizzando una pipetta di plastica trasferimento, delicatamente trasferire una larva ogni bene.
3. Dopo aver trasferito i pesci nei pozzetti, compila ogni pozzetto con acqua abbastanza pesce in modo tale che la superficie dell'acqua è quasi a filo con la parte superiore dei pozzetti. Sia eccessivo riempimento o underfilling il bene può causare problemi ottici per la macchina fotografica di registrazione. Inoltre, fare attenzione a non introdurre bolle nei pozzetti.

Parte 2: Indagine degli apparati di registrazione

Per questa parte del protocollo, si rimanda al film per identificare i componenti e per familiarizzare con il nostro set up degli apparecchi di registrazione.

1. All'interno della camera di registrazione è un luogo ben definito per posizionare la piastra a 96 pozzetti.
2. La telecamera è posizionata nella parte posteriore e si concentra sul piatto usando specchi fuori dalla scatola. L'angolo di questi specchi può essere regolata girando le viti che fissano gli specchi in posizione.
3. La camera di registrazione è illuminata dal basso da led a infrarossi. Questo permette alla telecamera di vedere i pesci anche al buio. Le larve non in grado di rilevare la luce a infrarossi, per cui questa illuminazione costante IR non influenza l'esperimento. LED bianchi illuminare anche la camera di registrazione dal basso. Sono controllati singolarmente dalle luci a infrarossi. Illuminando la camera con luce bianca dall'alto o dai lati è certamente possibile, ma in quei casi, bisogna fare attenzione per evitare forti riflessi sulla superficie dell'acqua che possono interferire con la fotocamera.
4. Per gli esperimenti che durano più di un paio d'ore, riempire la camera con acqua corrente per aiutare a mantenere una temperatura costante per tutta la durata sperimentale. Un modo per ottenere un flusso costante di acqua per pompare l'acqua da un serbatoio con una pompa piccolo acquario che viene riscaldato a 28 ° con un riscaldatore tipico acquario subacqueo.
5. Per ridurre al minimo le vibrazioni randagi dalla sala, l'unità intera registrazione dovrebbe sedersi su un tavolo equilibrio pesante.

Parte 3: Allineamento della piastra a 96 pozzetti con la rete del computer del video-tracking

Software

1. Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenenti il ​​pesce nella camera di registrazione.
2. Quando si utilizza un bagno d'acqua, lentamente la piastra in acqua, dando il livello dell'acqua la possibilità di regolare senza spargere sulla piastra. In alternativa, interrompono il flusso di acqua, aggiungere il piatto, e poi riprendere il flusso. Inoltre, assicurarsi di utilizzare una molla o un elastico per tenere la piastra a 96 pozzetti in posizione.
3. Nel software Videotrack Punto di vista, verificare che tutte le larve del vostro esperimento sono visibili sullo schermo del computer. Utilizzando i controlli del software, allineare la griglia del video-tracking software con i pozzi di piatto in modo che ogni pesce è all'interno di un quadrato della griglia. Il computer di tracciamento sarà il calcolo del movimento separatamente per ciascuna di queste caselle, quindi se si disallineare la griglia del computer alcuni tra i movimenti dei pesci può essere perso. O anche peggio: due pesci adiacenti occupare la stessa area e di essere contato come un pesce. Questo passaggio è molto importante per tutte le registrazioni.
4. Dopo l'allineamento, programma i tempi di quando le luci si dovrebbe andare on e off. Noi di solito consentono 3 ore di adattamento chiaro o scuro nella casella sia per ottenere un livello di attività di base, ma anche per dare le larve l'opportunità di calmarsi dopo il pipettaggio e maneggevolezza. Dopo la linea di base, che poi si alternano con 30 minuti di luci ON seguito da 30 minuti di luci spente, e ripetere più volte.
5. Quindi, chiudere la porta della camera di registrazione e avviare la registrazione.
6. In pratica, noi registriamo l'attività di ogni pesce per secondo, ma il software Punto di vista, infatti, registra i dati fotogramma per fotogramma (fare riferimento al filmper una dimostrazione della raccolta dei dati). Definizione del valore soglia minima per la modifica dei pixel per fotogramma dipenderà un po 'sulla fotocamera e la configurazione particolare della luce. Per il nostro sistema, si utilizzano in genere una soglia di 4 pixel, cioè se meno di 4 pixel stanno cambiando, si è ritenuto di fondo. Se più di 4 pixel in movimento, significa che il pesce è in movimento. Noi empiricamente determinato che questo taglio di rilevare quasi tutte le nuotare larvale e movimenti turno.
7. Anche se le caselle di registrazione isolare le larve abbastanza bene, spegnere la luce nella stanza e prendersi cura di ridurre al minimo le interruzioni con il rumore meccanico, come la chiusura e aprire le porte della stanza, una festa da ballo, o di fare la vostra routine di esercizi.

Parte 4: Analisi dei dati

1. Dopo l'esperimento è stato completato, il trasferimento dei dati raccolti in un foglio excel o nella vostra suite di analisi preferito.
2. Il foglio allegato excel è un esempio di ciò che i dati personali possono essere: contiene il tempo in secondi dall'inizio della sperimentazione e l'attività di ogni larva per secondi per tutti i pesci durante l'intero esperimento (vedi supplementare dei dati Esempio di file in la sezione File di questa pagina).
   
   
3. La figura 1 mostra un esempio di attività di una sola larva. Figura 2 è una traccia rappresentativo della media di 40 larve di zebrafish WT. La media di ON e OFF sono le risposte e di primo piano.
   
   
   
   Figura 1: Attività di un singolo pesce L'attività di un singolo pesce WT a 5 dpf in risposta a periodi alternati di 30 minuti di luce ON e OFF.. Le risposte ON sono indicati da frecce nere e le risposte OFF con frecce rosse.
   
   
   
   Figura 2: l'attività media di 40 pesci L'attività media di 40 pesci WT a 5 dpf in risposta a periodi alternati di 30 minuti di luce ON e OFF.. La media di ON (frecce nere) e OFF (frecce rosse) sono le risposte e di primo piano.

5. Rappresentante Risultati

Figura 3 è un profilo schematico del contorno sperimentali utilizzati in tutti i nostri esperimenti.



Figura 3. Disegno sperimentale di Visual risposta motoria (VMR) test.) Pesci singoli sono posti in una piastra a 96 pozzetti in una camera di registrazione. L'attività di ogni pesce è misurata al secondo. B) I pesci sono concesso un periodo di adattamento al buio o luce per risolverle e per ottenere un livello di attività di base. Periodi di 30 minuti su luci e le luci spente vengono introdotti consecutivamente per un totale di 3 ore. Questo schema è stato adattato da Prober et al., 2006.

Qual è il Visual-Motor grafici di risposta simile?

Abbiamo misurato le risposte ON e OFF di pesce WT alla luce incrementi e decrementi. Per confermare che queste risposte sono state dipende dalla funzionalità degli occhi, abbiamo misurato l'attività dei mutanti chk, che non sviluppano alcun occhi. La Figura 4 mostra l'attività di medi ottenuti da animali WT così come i mutanti chk.



Figura 4: pesce WT hanno chiare ON e OFF risposte che sono mediati dagli occhi laterali Il comportamento locomotorio di larve di pesce zebra a 5 dpf in risposta a 30 minuti di luce ON e OFF 30 minuti di luce è registrato al secondo.. Ogni traccia rappresenta una media di 480 risposte da 120 singoli WT (traccia blu) o chk larve mutanti (arancione traccia) ha registrato oltre 3 esperimenti. I mutanti chk non aumentare significativamente la loro attività sia a incrementi o decrementi luce e hanno un basso livello basale di attività. Questo dato è stato adattato da Emran et al., 2007.

Visual-Motor Risposte dal pesce NRC mutante.

Il mutante NRC è stato pensato per essere completamente cieco in base al test okr. Nel mutante NST, i terminali dei fotorecettori non fanno correttamente e l'On percorso visivo è gravemente compromessa ^1. Le registrazioni delle cellule gangliari della retina di questi pesci mutanti ha rivelato che essi presentano prevalentemente OFF-tipo le risposte delle cellule gangliari, alcuni anomali ON-OFF, ma non pura risposte di tipo ^On-2.

Usando il test VMR abbiamo dimostrato che il mutante NRC ha un normale OFF-risposta e un ritardato e lento ON-risposta (see Figura 5). Così, il mutante NRC non è completamente cieco come si pensava ^2.


Figura 5: mutats NRC aumentare la loro attività in risposta ai cambiamenti di intensità di luce risposte comportamentali alla luce ON e OFF da WT e larve nrc mutanti a 5 dpf.. Ogni traccia rappresenta una media di 480 risposte da 120 singoli pesci di ogni genotipo. Il comportamento locomotorio media di mutanti NRC (tracce rosa) è leggermente ridotta rispetto al pesce WT (tracce blu) ma rimane vigorosa seguendo la luce OFF stimolo. Si noti il tempo lento aumento della risposta NRC mutante alla luce ON rispetto alla luce ON risposta del pesce WT.

Discussione

Le procedure sperimentali mostriamo nel film sono tutti rappresentativi di pesce WT. Tuttavia, questi esperimenti può essere fatto in modo analogo sul pesce mutante così (vedi risultato spaccato rappresentativo). Si consiglia di pesce piatto WT e pesce mutante nello stesso piatto in uno schema a scacchiera ai fini del controllo ottimale.

Quando si utilizza pesce mutante nello stesso piatto di pesce WT assicurarsi di scrivere ciò che tipo di pesce è stato placcato in ciascun pozzetto. Ecco un suggerimento su come tenere traccia d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR international	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences