Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

Resumo

Nós desenvolvemos o Response Visual-Motor para quantificar a saída do motor de zebrafish larval em resposta aos aumentos de luz e diminui. Também examinamos os mutantes visão zebrafish, incluindo a resposta não optocinético (NRC) mutantes, que foram pensados ​​para serem completamente cego quando testado por um outro ensaio de visão, o reflexo optocinético.

Resumo

O reflexo optocinético (OKR) é um visual básico reflexo exibida pela maioria dos vertebrados e desempenha um papel importante na estabilização do olho em relação à cena visual. No entanto, o OKR exige que um animal detectar riscas em movimento e é possível que os peixes que não exibem um OKR não pode ser completamente cega. Um peixe-zebra mutante, a não optocinético resposta c (NRC) não tem nenhuma OKR sob quaisquer condições de luz testadas e foi relatado para ser completamente cego. Anteriormente, mostramos que OFF-atividade das células ganglionares podem ser gravadas nestes mutantes. Para determinar se os peixes mutantes sem OKR como o mutante nrc pode detectar incrementos de luz simples e decrementa nós desenvolvemos o teste do motor visuais comportamentais (VMR). Neste ensaio, larvas do peixe única são colocados em cada poço de uma placa de 96 poços permitindo o monitoramento simultâneo de larvas através de um sistema de vídeo monitoramento automatizado. As respostas locomotor de cada larva a 30 minutos-luz ON e 30 minutos OFF luz foram registrados e quantificados. WT peixes têm um pico breve da atividade motora sobre luzes ON, conhecida como a resposta de sobressalto, seguido pelo retorno a menor do que a atividade de base, chamada de congelar. Peixes WT também aumentar drasticamente sua atividade locomotora imediatamente após luzes apagadas e apenas gradualmente (durante vários minutos) retornar à atividade locomotora basal. Os mutantes nrc responder de maneira similar à luz OFF como peixes WT, mas apresentam uma ligeira redução em sua atividade média, em comparação aos peixes WT. Atividade motora em resposta à luz ON em nrc mutantes é atrasado e lento. Há um tempo de subida lenta da resposta mutante nrc à luz ON, em comparação com luz WT ON resposta. Os resultados indicam que os peixes nrc não são completamente cegos. Porque teleósteos podem detectar a luz através da retina não-tecidos, que confirmou que as respostas imediatas de comportamento à luz de intensidade mudanças requerem olhos intactos usando o chokh (chk) mutantes, o que falta completamente os olhos, desde os primeiros estágios de desenvolvimento. No nosso ensaio VMR, os mutantes chk não apresentam resposta de sobressalto a qualquer luz ON ou OFF, mostrando que os olhos laterais mediar esse comportamento. O ensaio aqui descrito VMR complementa o ensaio OKR bem estabelecido, que não testa a capacidade de larvas de peixe-zebra para responder às mudanças nas intensidades de luz. Além disso, a automação do ensaio VMR se presta a high-throughput screening para defeitos de intensidade leve-driven respostas visual.

Protocolo

Este protocolo descreve as etapas para realizar a resposta Visual-Motor de larvas de peixe-zebra a incrementos de luz e decrementos em seu próprio laboratório. Peixe-zebra é um sistema grande modelo para estudos comportamentais. Eles são fáceis de manter, eles têm tamanhos de embreagem grandes, e elas se desenvolvem rapidamente. Por exemplo, os olhos de larvas de peixe-zebra são sensíveis a luz do dia 3 de desenvolvimento e momento em que eles exibem uma resposta de sobressalto.

Parte 1: Plating peixes individuais em uma placa de 96 poços

1. Crescer larvas WT sob um ciclo claro / escuro a 28 ° C, até pelo menos 4 dias após a fertilização (DPF). Nossa luz típico: ciclo escuro é de 14 horas de luzes acesas a partir de 09h00, e 10 horas de luzes OFF, a partir das 11:00. Para obter os melhores resultados comportamentais, evitar a superlotação, que geralmente não tenham mais de 50 larvas em uma única placa de Petri.
2. Após 4 dpf, o peixe-zebra estão prontos para serem transferidos para uma placa de 96 poços. Para dar mais espaço para as larvas de natação, que tipicamente usam uma placa de 96 poços com uma grande e bem-size de 650 mL, no entanto, o padrão placas de 96 poços funcionar muito bem. Usando uma pipeta de transferência de plástico, gentilmente transferência de uma larva por poço.
3. Após a transferência dos peixes para os poços, preencha cada poço com peixes de água suficiente de modo que a superfície da água é quase rente ao topo dos poços. Ou overfilling ou enchimento baixo o bem pode causar problemas ópticos para a câmara de gravação. Além disso, tome cuidado para não introduzir bolhas nos poços.

Parte 2: Levantamento de aparelhos de gravação

Para esta parte do protocolo, por favor consulte o filme para identificar os componentes e para se familiarizar com a nossa criação do aparelho de gravação.

1. Dentro da câmara de gravação é um local bem definido para a posição da placa de 96 poços.
2. A câmera está posicionada na parte de trás e está focado na placa usando espelhos fora da caixa. O ângulo desses espelhos pode ser ajustada girando os parafusos que prendem os espelhos no lugar.
3. A câmara de gravação é iluminado a partir do fundo por LEDs infravermelhos. Isso permite que a câmera para ver os peixes mesmo no escuro. As larvas não conseguem detectar luz infravermelha, por isso essa iluminação IR constante não afeta o experimento. LEDs brancos também iluminar a câmara de gravação de baixo. Eles são controlados separadamente das luzes de IR. Iluminando a câmara com luz branca a partir de cima ou a partir dos lados é certamente possível, no entanto, nesses casos, os cuidados devem ser tomados para evitar fortes brilhos para fora da superfície da água que podem interferir com a câmera.
4. Para experimentos que duram mais de um par de horas, preencher a câmara com cuidado em água para ajudar a manter uma temperatura constante durante todo o período experimental. Uma forma de conseguir um fluxo constante de água é para bombear água de um reservatório por uma bomba de aquário pequeno, que é aquecida a 28 ° com um aquecedor de aquário típico debaixo d'água.
5. Para minimizar a vibração desviar-se da sala, a unidade de gravação inteiro deve sentar em cima de uma mesa de equilíbrio pesado.

Parte 3: Alinhamento da placa de 96 poços com a rede informática do vídeo-tracking

Software

1. Coloque a placa de 96 poços contendo os peixes para dentro da câmara de gravação.
2. Quando se utiliza um banho de água, lentamente colocar a placa na água, dando o nível da água a chance de ajustar sem derramar sobre o prato. Em alternativa, desligar o fluxo de água, adicionar a placa, e depois retomar o fluxo. Além disso, certifique-se de usar uma mola ou um elástico para segurar a placa de 96 poços no local.
3. No software Videotrack Viewpoint, verifique se todas as larvas de sua experiência são visíveis na tela do computador. Usando os controles do software, alinhar a grade do software de monitoramento de vídeo com os poços do seu prato de forma que cada peixe é dentro de um quadrado da grade. O computador de rastreamento será calcular o movimento separadamente para cada uma destas caixas, então se você desalinhar a grade computador alguns dos movimentos dos peixes podem ser perdidos. Ou pior ainda: dois peixes adjacentes vai ocupar a mesma área e ser contado como um peixe. Este passo é muito importante para todas as suas gravações.
4. Após o alinhamento do programa, o tempo para quando as luzes deve ir ligado e desligado. Nós geralmente permitem três horas de adaptação claras ou escuras na caixa tanto para obter um nível de atividade de base, mas também para dar as larvas uma oportunidade para se acalmar após a pipetagem e manuseio. Após a linha de base, nós então alternam-se com 30 minutos de luzes ON seguido de 30 minutos de luzes OFF, e repetir várias vezes.
5. Em seguida, feche a porta da câmara de gravação e iniciar a gravação.
6. Na prática, registrar a atividade de cada peixe por segundo, mas o software Ponto de Vista, na verdade registra o quadro a quadro de dados (veja o filmepara uma demonstração da coleta de dados). O estabelecimento do limiar mínimo para a mudança de pixels por quadro vai depender um pouco da sua câmera especial e configuração de luz. Para nossa configuração, que geralmente usam um limiar de 4 pixels, ou seja, se menos de 4 pixels estão mudando, considera-se fundo. Se mais de 4 pixels estão se movendo, indica que o peixe está se movendo. Nós empiricamente determinou que este corte detecta quase todos nadar o larval e movimentos vez.
7. Mesmo que as caixas de gravação de isolar as larvas razoavelmente bem, desligar a luz no quarto e tomar cuidado para minimizar as interrupções com o ruído mecânico, como fechar e abrir as portas da sala, tendo uma festa de dança, ou fazendo suas rotinas de exercícios.

Parte 4: Analisando os dados

1. Após a experiência é completada, transferir os dados coletados em uma folha excel ou em sua suíte de análise favorito.
2. A folha de excel em anexo é um exemplo do que os dados podem parecer: ele contém o tempo em segundos desde o início do experimento ea atividade de cada larva por segundo para todos os peixes durante todo o experimento (Veja Dados complementares Exemplo de arquivo em seção Arquivos desta página).
   
   
3. A Figura 1 mostra um exemplo da atividade de uma larva único. A Figura 2 é um traço representativo da média de 40 larvas de peixe-zebra WT. A média de ON e OFF respostas são proeminentes e consistente.
   
   
   
   Figura 1: Atividade de um único peixe A atividade de um único peixe WT menos 5 dpf em resposta a períodos alternados de 30 minutos-luz ON e OFF.. As respostas ON são indicadas por setas pretas e as respostas OFF com setas vermelhas.
   
   
   
   Figura 2: A atividade média de 40 peixes A atividade média de 40 peixes, 5 WT dpf em resposta a períodos alternados de 30 minutos-luz ON e OFF.. A média ON (setas pretas) e OFF (setas vermelhas) respostas são proeminentes e consistente.

5. Resultados representante

Figura 3 é um esboço esquemático do delineamento experimental utilizado em todas as nossas experiências.



Figura 3. Delineamento experimental do teste de resposta Motor Visual (VMR). Um peixe) individuais são colocados em uma placa de 96 poços em uma câmara de gravação. A atividade de cada peixe é medido por segundo. B) Os peixes são de um período de adaptação ao escuro ou luz para resolvê-las e obter um nível de atividade de base. Períodos de 30 minutos em luzes e luzes OFF são introduzidos consecutivamente para um total de 3 horas. Este diagrama foi adaptado de Sondador et al., 2006.

O que os gráficos Visual-Motor resposta parece?

Medimos as respostas ON e OFF de peixes WT a incrementos de luz e diminui. Para confirmar que estas respostas foram depende da função dos olhos, nós medimos a atividade de mutantes chk, que não desenvolvem nenhum dos olhos. A Figura 4 mostra a atividade média obtida de animais WT, bem como os mutantes chk.



Figura 4: WT peixes têm clara ON e OFF respostas que são mediadas pelos olhos laterais O comportamento locomotor de larvas de peixe-zebra, 5 dpf em resposta a 30 minutos de luz ON e 30 minutos de luz OFF é gravado por segundo.. Cada traço representa uma média de 480 respostas de 120 WT individual (azul traço) ou larvas chk mutante (laranja trace) registrou mais de 3 experimentos. Os mutantes chk não aumentar significativamente a sua actividade, quer incrementos ou decrementos luz e têm um nível basal baixa de atividade. Este valor foi adaptado de Emran et al., 2007.

Visual-Motor respostas do peixe mutante nrc.

O mutante nrc foi pensado para ser completamente cego com base no teste OKR. No mutante nrc, os terminais de fotorreceptores não formam adequadamente e que o On via visual é severamente comprometida ^1. Gravações ganglionares da retina de células a partir desses peixes mutantes revelaram que eles exibem predominantemente OFF-tipo de respostas de células ganglionares, algumas anormal ON-OFF, mas não pura No tipo ² respostas.

Utilizando o teste de VMR nós mostramos que o mutante tem um NRC normais OFF-resposta e um atrasado e lento ON-resposta (SEe Figura 5). Assim, o mutante nrc não é completamente cego como se pensava anteriormente ^2.


Figura 5: mutats Nrc aumentar a sua actividade em resposta a mudanças na intensidade de luz respostas comportamentais à luz ON e OFF de WT e larvas nrc mutante menos 5 dpf.. Cada traço representa uma média de 480 respostas de 120 peixes individuais de cada genótipo. O comportamento locomotor média de mutantes NRC (traços-de-rosa) é ligeiramente reduzida, em comparação com os peixes WT (traços azuis), mas permanece vigoroso seguindo a luz OFF estímulo. Observe o tempo de subida lenta na resposta mutante nrc à luz ON comparação com a luz sobre a resposta dos peixes WT.

Discussão

Os procedimentos experimentais que mostram no filme são todos representativos de peixes WT. No entanto, estas experiências podem ser feitas de forma análoga em peixes mutantes também (ver secção resultado representativo). Sugerimos aos peixes placa WT e peixes mutantes na mesma placa em um esboço placa de verificador para fins de controle ótimo.

Ao usar peixes mutantes no mesmo prato como peixe WT certifique-se que você anote o tipo de peixe era banhado em cada poço. Aqui está uma sugestão sobre como acompanhar o peixe b...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR international	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences