注意：在以无菌方式处理混合瘤细胞和介质时（例如，在生物安全柜中），在抗体净化步骤之前，应保持无菌细胞培养技术。

1. 解冻冷冻杂交细胞

1. 在37°C水浴中孵育含有冷冻杂交瘤细胞的瓶，直到刚解冻（约2分钟）。
2. 将解冻细胞加入含有10 mL完整RPMI（RPMI补充10%胎儿牛血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、1mM丙酸钠、1x非必需氨基酸、50μM 2-Mercaptoto酸、10mM HEPES）的15mL锥形管中。
3. 在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以洗掉任何污染冷冻介质。
4. 离心后，丢弃液体上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在5 mL新鲜完整的RPMI中。然后，将细胞添加到含有15 mL完整RPMI（RPMI最终体积为20 mL）的T75组织培养瓶中。
5. 在37°C的标准培养箱中生长_细胞，CO2为5%。在培养中，细胞是非粘附的。

2. 杂交瘤扩张

1. 让细胞膨胀约3天，直到烧瓶是+80%的汇入。
   注意：此时间量可能因细胞的起始数量以及不同细胞的生长速率的固有差异而异。细胞处于指数生长阶段非常重要。
2. 一旦初始烧瓶达到+80%的汇合，从初始T75烧瓶中取出细胞，放入圆锥形离心管中，旋转（1200 RPM，5分钟）以颗粒细胞。
3. 将细胞悬浮在6 mL的完整RPMI中，然后将细胞悬浮液分配到三个新的T75瓶（2 mL/烧瓶，含有18 mL RPMI）。在 37°C 下用 5% CO₂孵育这三个 T75 烧瓶，直到它们发生 ±80% 的汇合（这大约需要 3 天）。

3. 无血清介质中的抗体生产

注意：此时，细胞准备在专为杂交瘤细胞系生长而设计的无血清培养基中继续生长。在此协议中，我们使用含有 HB101 补充剂产品的即用型、商用 HB 基础液体介质。

1. 三个 T75 烧瓶中的每个细胞（在 ±80% 汇合时）被收集并离心（1200 RPM，5 分钟）。
2. 每个T75瓶中的细胞颗粒被重新悬浮在10 mL补充的HB101无血清培养基中，然后加入两个T225烧瓶补充HB101无血清介质（即5 mL细胞悬浮液，每个瓶中每个瓶中含有+220-240 mL HB101）。
3. 在 37°C 的 T225 烧瓶和 HB101 介质中继续生长，在 5% CO₂下生长三周，或直到细胞开始死亡。细胞在这3周内产生mAb，并将其分泌到培养基中。一旦细胞开始死亡，它们就不再产生任何mAb。

4. 抗体纯化 - 第1天

注意：此时，不需要保持无菌，因此无需以无菌方式处理介质（例如，在生物安全柜中）。此外，杂交瘤不被视为"BSL2级"代理。

1. 将烧瓶中的介质倒入管中，用于固定角度转子。在10，000RPM的固定角度转子的离心机中旋转管子8分钟。此步骤旨在从培养液上清液中清除细胞碎片。
   注意：管尺寸可能因使用的转子而异。要记住的重要的事情是，在管中具有相同的体积，以确保转子在离心前得到适当的平衡。介质的整个体积可能一次无法放入离心机中。其余介质稍后将使用相同的管离心（步骤 4.5）。
2. 在被冰包围的桶中，用搅拌棒准备一个 2L 塑料烧杯。放在搅拌盘上。
3. 在 1L 瓶上安装 500 mL 的过滤器顶部。通过适当的管道将瓶顶过滤单元连接到室内真空。
4. 将步骤 4.1 中的上清液（仍包含杂交细胞产生的 mAb）倒入过滤器顶部。
5. 继续使用同一组管从介质中颗粒细胞碎片（颗粒将继续生成）。等待运行真空，直到过滤器顶部已满，另一批上清液准备倒入。不要让过滤器变干或过滤会变得很慢。
6. 当 1L 瓶接近满时，取出滤芯顶部并将上清液倒入步骤 4.2 中准备的 2L 烧杯中。重新连接过滤器顶部。跟踪卷。
7. 重复离心和过滤步骤，直到处理所有介质。
8. 每收集1L过滤上清液，可测量出295克硫酸铵。搅拌时，在接下来的几个小时内（每15分钟约25克）缓慢地将硫酸铵加入上清液中，以防止硫酸铵盐的局部高浓度，可能导致不需要的蛋白质沉淀。
9. 加入所有硫酸铵后，用铝箔盖住烧杯，用搅拌板移动到 4°C（例如，步入式冰箱或冷藏室）。搅拌过夜。溶液的不断搅拌需要使盐溶解，但长时间的搅拌会导致溶液中蛋白质在表面/空气界面上的变性。
10. 使用固定角度转子清洗管。

5. 抗体纯化 - 第2天

1. 将含有上清液的硫酸铵从 2L 烧杯倒入管中，用于固定角度转子。在离心机中旋转，在6500RPM下固定角度转子，无需制动，旋转20分钟。
2. 真空吸出上清液，注意不要吸起颗粒，因为它将是软的。继续使用同一组管子从含有上清液的硫酸铵中收集颗粒。
3. 在最后一次吸入后，将每个颗粒（含有抗体）重新悬浮在+1 ml PBS中。
4. 通过对大量PBS的透析，从沉淀的mAb溶液中去除硫酸铵。为此，首先为 mAb 溶液的每个 mL 切割大约 1 英寸的透析管（例如，Membra-Cel MD25-14 MWCO 12，000-14，000 道尔顿切断纤维素透析管）。用 dH₂O 将管子与管子的一端打结，然后用 dH₂O 填充，以检查该结是否泄漏。从管中清空 dH₂O。
5. 移液器 PBS/抗体溶液进入管材。用额外的 0.25 ml PBS 冲洗管，然后转移到管中。
6. 使用橙色透析夹将管的顶部固定在尽可能靠近溶液的地方。
7. 将油管顶部贴在 4L 烧杯的外顶部。让油管的填充部分悬挂到烧杯中。用 PBS 填充烧杯，并添加搅拌棒。
8. 在4°C下搅拌8小时。
9. 用新鲜的 PBS 更换烧杯中的 PBS，再搅拌 8 小时。
10. 将抗体从管转移到15或50毫升锥形管。在 1200 RPM 下离心 5 分钟，以清除可能形成的任何沉淀物。将上清液转移到新鲜的管子上。
11. 用PBS（5μl抗体+ 95μlPBS）稀释抗体的等分1：20。用分光光度计（带PBS的空头）在280nm处定量抗体浓度。使用消光系数 （+） 1.43。浓度计算为
    
    
12. 将抗体与螺钉盖小瓶进行比对，并储存在 -80°C。