Hinweis: Die Sterile Zellkulturtechnik sollte beim sterilen Umgang mit den Hybridomzellen und den Medien (z. B. in einem Biosicherheitsschrank) bis zu den Antikörperreinigungsschritten aufrechterhalten werden.

1. Auftauen gefrorener Hybridomzellen

1. Inkubieren Sie die Durchstechflasche mit den gefrorenen Hybridomzellen in einem 37°C Wasserbad, bis sie gerade aufgetaut ist (ca. 2 Minuten).
2. Fügen Sie die aufgetauten Zellen zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu, das 10 ml vollständiges RPMI enthält (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 1mM Natriumpyruvat, 1x nicht essentielle Säuren Aminosäuren, 50 m 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
3. Zentrifuge für 5 min bei 1200 U/min, um alle kontaminierenden Gefriermedien auszuwaschen.
4. Nach der Zentrifugation den flüssigen Überstand entsorgen und das Zellpellet in 5 ml frischem, vollständigem RPMI wieder aufhängen. Fügen Sie dann die Zellen zu einem T75-Gewebekulturkolben hinzu, der 15 ml vollständiges RPMI enthält (endletztes Volumen von RPMI beträgt 20 ml).
5. Wachsen Sie die Zellen in einem Standard-Inkubator bei 37°C mit 5%_CO2. Zellen sind in der Kultur nicht haftende.

2. Hybridom-Erweiterung

1. Lassen Sie die Zellen für etwa 3 Tage zu erweitern, bis der Kolben ist 80% konfluent.
   Hinweis: Diese Zeit kann je nach Startzahl der Zellen sowie inhärenten Unterschieden in den Wachstumsraten verschiedener Zellen variieren. Es ist wichtig, dass sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.
2. Sobald der Anfangskolben die Koninfluenza von 80 % erreicht hat, entfernen Sie die Zellen aus diesem anfänglichen T75-Kolben, legen Sie sie in ein konisches Zentrifugenrohr und drehen Sie (1200 U/min für 5 min), um die Zellen zu pellet.
3. Setzen Sie die Zellen in 6 ml vollständiger RPMI wieder auf, und verteilen Sie die Zellsuspension dann in drei neue T75-Kolben (2 ml/Kolben mit 18 ml RPMI). Inkubieren Sie diese drei T75-Kolben bei 37°C mit 5%_CO2, bis sie zu 80% konfluent sind (Dies sollte ca. 3 Tage dauern).

3. Antikörperproduktion in serumfreiem Medium

Hinweis: An diesem Punkt sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in einem serumfreien Medium fortzusetzen, das für das Wachstum von Hybridom-Zelllinien entwickelt wurde. In diesem Protokoll verwenden wir das gebrauchsfertige, handelsübliche HB Basal Liquid Medium, das das HB101 Supplement Produkt enthält.

1. Die Zellen aus jedem der drei T75-Kolben (bei einer Konfluenz von 80 %) werden gesammelt und zentrifugiert (1200 U/min für 5 min).
2. Das Zellpellet aus jedem T75-Kolben wird in 10 ml ergänztem HB101-Serummedium resuspendiert und dann zu zwei T225-Flaschen hinzugefügt, die HB101-Serum-freies Medium ergänzten (d. h. 5 ml Zellsuspension in jedem von 6 Kolben mit einem Inhalt von 220-240 ml HB101 in jedem Kolben).
3. Die Zellen in T225-Flaschen und HB101-Medien bei 37 °C mit 5%_CO2 für drei Wochen weiter anbauen, oder bis die Zellen zu sterben beginnen. Die Zellen produzieren mAb während dieser 3 Wochen und verschwiegen es in das Kulturmedium. Sobald die Zellen zu sterben beginnen, produzieren sie kein mAb mehr.

4. Antikörperreinigung - Tag 1

Hinweis: An dieser Stelle muss die Sterilität nicht aufrechterhalten werden, so dass ein steriler Umgang mit den Medien (z. B. in einem Biosicherheitsschrank) nicht erforderlich ist. Darüber hinaus werden Hybridome nicht als "BSL2-Level"-Agent betrachtet.

1. Gießen Sie Medien aus den Kolben in Rohre für einen festen Winkelrotor. Drehen Sie die Rohre in einer Zentrifuge mit einem festen Winkelrotor bei 10.000 U/min für 8 Minuten. Dieser Schritt wurde entwickelt, um die zellulären Trümmer aus dem Kulturüberstand zu entfernen.
   Hinweis: Die Rohrgrößen können je nach verwendeter Rotor variieren. Wichtig ist, das gleiche Volumen in den Rohren zu haben, um sicherzustellen, dass der Rotor vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert ist. Es ist wahrscheinlich, dass das gesamte Volumen der Medien nicht gleichzeitig in die Zentrifuge passt. Die restlichen Medien werden später (Schritt 4.5) mit den gleichen Rohren zentrifugiert.
2. Bereiten Sie einen 2L Plastikbecher mit einer Rührstange in einem Eimer, der von Eis umgeben ist. Auf eine Rührplatte legen.
3. Befestigen Sie eine 500 ml Filterplatte an einer 1L-Flasche. Befestigen Sie die Flaschen-Top-Filtereinheit, um Vakuum über geeignete Schläuche zu beherbergen.
4. Gießen Sie den Überstand aus Schritt 4.1 (der noch das von den Hybridomzellen produzierte mAb enthält) in die Filteroberseite.
5. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um Zellablagerungen aus den Medien zu pellet (das Pellet wird weiter zu bauen). Warten Sie, bis das Vakuum ausgeführt wird, bis die Filteroberseite voll ist und eine weitere Charge über den Überstand bereit ist, hineinzugießen. Lassen Sie den Filter nicht austrocknen oder die Filterung wird sehr langsam.
6. Wenn die 1L-Flasche fast voll ist, entfernen Sie die Filterplatte und gießen Sie Überstand in 2L Becher in Schritt 4.2 vorbereitet. Schließen Sie das Filteroberteil wieder an. Verfolgen Sie die Lautstärke.
7. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Filtrationsschritte, bis alle Medien verarbeitet sind.
8. Messen Sie 295g Ammoniumsulfat pro 1L gefilterten Überstand gesammelt. Während des Rührens, langsam fügen Sie das Ammoniumsulfat dem Überstand in den nächsten paar Stunden (ca. 25 g alle 15 Minuten) langsam, um eine lokalisierte hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz zu verhindern, die unerwünschte Proteine zum Niederschlag führen kann.
9. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat zugegeben ist, den Becher mit Folie bedecken und mit der Rührplatte auf 4°C (z.B. begehbarer Kühlschrank oder Kühlraum) bewegen. Über Nacht umrühren. Um das Salz zu löslich zu machen, ist ein ständiges Rühren erforderlich, aber ein längeres Rühren kann zu einer Denaturierung der Proteine in der Lösung an der Oberflächen-/Luftschnittstelle führen.
10. Waschen Sie die Rohre mit dem Festwinkelrotor.

5. Antikörperreinigung - Tag 2

1. Gießen Sie das Ammoniumsulfat, das Überstand aus dem 2L-Becherglas enthält, in Rohre für einen festen Winkelrotor. Drehen Sie in Zentrifuge mit Festwinkelrotor bei 6500 U/min für 20 Minuten ohne Bremse.
2. Vakuum aspirat den Überstand, achten Darauf, nicht das Pellet zu saugen, wie es weich sein wird. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um Pellet aus dem Ammoniumsulfat zu sammeln, das Überstand enthält.
3. Nach der letzten Aspiration jedes Pellet (das Antikörper enthält) in 1 ml PBS wieder aussetzen.
4. Entfernen Sie das Ammoniumsulfat aus der gefällten mAb-Lösung durch Dialyse gegen große Mengen pbS. Dazu zunächst ca. 1 Zoll Dialyseschlauch (z.B. Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Dalton Cut-off Cellulose Dialyseschläuche) für jeden ml mAb-Lösung schneiden. Befeuchten Sie den Schlauch mit dH₂O. Binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauches und füllen Sie ihn mit dH₂O, um zu überprüfen, ob der Knoten nicht austritt. Leer dH₂O aus dem Schlauch.
5. Pipette PBS/Antikörperlösung in den Schlauch. Spülen Sie die Tuben mit einem zusätzlichen 0,25 ml PBS, und übertragen Sie auf die Schläuche.
6. Sichern Sie die Oberseite des Schlauches so nah wie möglich an der Lösung mit einem orangefarbenen Dialyseclip.
7. Kleben Sie die Oberseite des Schlauches an die Außenoberseite eines 4L Bechers. Lassen Sie den gefüllten Teil des Schlauches in den Becher hängen. Füllen Sie den Becher mit PBS und fügen Sie eine Rührstange hinzu.
8. Über Nacht für 8 Stunden bei 4°C rühren.
9. Ersetzen Sie die PBS im Becher durch frische PBS und rühren Sie für 8 Stunden zwei weitere Male.
10. Den Antikörper aus dem Schlauch in 15- oder 50-ml-Konustuben übertragen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 1200 U/min, um eventuelle Niederschlagserscheinungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr.
11. Verdünnen Sie ein Aliquot von Antikörper 1:20 mit PBS (5 l Antikörper + 95 l PBS). Quantitieren Sie die Antikörperkonzentration mit einem Spektralphotometer (leer mit PBS) bei 280 nm. Verwenden Sie einen Aussterbekoeffizienten () von 1,43. Die Konzentration wird als
    
    
12. Aliquot den Antikörper in Schraubverschlussfläschchen und lagern bei -80°C.