首先，将 3.75 毫升还原血清培养基移液到标记为 A 的试管中，并用 105 μL 转染试剂稀释培养基。涡旋管中的内容物以充分混合。接下来，将3.75毫升还原血清培养基加入标记B.用90μL增强剂试剂稀释表达质粒的试管中。
现在将试管 A 的内容物加入试管 B 中，并在孵育前将溶液移液充分混合。小心地从准备好的 Phoenix 生态板中取出 10 毫升细胞培养基。然后将整个体积的转染混合物滴加到板中。
在培养箱中以37摄氏度孵育细胞。将MTCM病毒收获培养基置于37摄氏度的水浴中预热。现在倾斜 Phoenix 生态板并移出培养基。
接下来，将 30 毫升预热的病毒收获培养基缓慢移液到倾斜的培养基中。将细胞放回培养箱中。转染48小时后，收获病毒上清液。
通过 0.45 微米 PVDF 过滤器过滤。用无菌注射器的背面，通过70至100微米的细胞过滤器将分离的鼠脾粉碎到50毫升的锥形管中。然后用 5 毫升 T 细胞分离缓冲液清洗过滤器。
将细胞的最终体积达到 50 毫升后，用血细胞计数器计数细胞。通过在4°C或室温下以450G离心10分钟来沉淀细胞。使用推荐的 T 细胞分离试剂盒重悬含有脾细胞的细胞沉淀。
然后使用阴性选择分离 CD3 阳性 T 细胞。将磁性分离的隔离物转移到 15 毫升锥形管中。再次检查单元格计数。
将分离的T细胞在450G下以4摄氏度离心10分钟。然后将细胞沉淀重悬于MTCM活化培养基中。现在将抗体包被的磁珠和白细胞介素-2添加到细胞悬液中以激活T细胞。
将细胞在 37 摄氏度下孵育过夜。在第0天，用0.5毫升人纤连蛋白转导增强剂预涂未经处理的无菌24孔板。将板存放在四摄氏度下过夜。
第二天，从孔中取出转导试剂。在室温下用等体积的无菌过滤BSA补充PBS封闭孔30分钟。孵育后，除去 BSA PBS 并用 0.5 至 1 毫升 PBS 洗涤孔。
接下来，在每个预包被的孔中加入一毫升纯逆转录病毒。在32摄氏度下以2,000G离心板90分钟。然后向每个病毒负载的孔中加入一毫升活化的T细胞。
在32摄氏度下再次以450G离心板10分钟。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。在第五天，重悬细胞以将活化的T细胞与抗体包被的珠子解离。
将细胞悬浮液放在磁铁上 30 秒。然后将悬浮液转移到离体培养容器中。在流式细胞术分析之前，将容器置于37摄氏度的培养箱中。
使用T细胞分离试剂盒在转导前产生的T细胞纯度低于98%。CAR的可重复表达率为65%至75%。白细胞介素-7 和 15 的体外培养导致单个脾脏激活后第 10 天的 15 倍。
用白细胞介素培养 T 细胞可产生相当的 CD8 阳性和 CD4 阳性 T 细胞频率。体外培养10天后，观察到干细胞记忆群被保存。
