DNA张力探针用于绘制免疫细胞的瞬时皮牛顿受体力

该协议提供了一种绘制细胞，特别是免疫细胞产生的分子力的方法。该协议对于有兴趣研究机械生物学机械转导的实验室至关重要。该技术的主要优点是它非常容易，并且允许使用传统的荧光显微镜来量化永生化细胞和原代细胞中的力传递。

首先，将 25 毫米盖玻片放在 50 毫升烧杯中的聚四氟乙烯架上，并通过将它们浸入水中来冲洗盖玻片三次。混合等体积的乙醇和水，并将40毫升该溶液加入装有架子和盖玻片的烧杯中。然后，使用封口胶带密封烧杯。

通过在超声波清洁器中超声处理烧杯 15 分钟来清洁盖玻片，并在超声处理后丢弃液体。然后，用水冲洗装有架子和盖玻片的烧杯至少六次，以去除任何残留的有机溶剂。要制备新鲜的食人鱼溶液，请在 50 毫升烧杯中加入 30 毫升硫酸，然后慢慢加入 10 毫升过氧化氢。

使用玻璃移液管的末端轻轻混合食人鱼溶液。要开始蚀刻，将装有盖玻片的架子转移到装有食人鱼溶液的烧杯中，并在室温下孵育 30 分钟以清洁盖玻片并将其羟基化。然后，使用钢或聚四氟乙烯镊子将架子转移到干净的 50 毫升烧杯中，并用水冲洗六次。

为了完全除去水，将装有盖玻片的架子浸入装有40毫升乙醇的50毫升烧杯中。然后，丢弃乙醇。接下来，将架子浸入含有3%氨丙基三乙氧基硅烷的40毫升乙醇中，在室温下一小时，以引发与盖玻片上的羟基的反应。

将盖玻片浸入40毫升乙醇中冲洗盖玻片表面六次，然后在80摄氏度的烤箱中干燥20分钟。用封口膜胶带覆盖培养皿的内底部，以防止盖玻片在培养皿内滑动。然后将胺覆盖的盖玻片放在要功能化的一侧，DNA张力探针朝上。

盖上盖玻片，温度为20摄氏度，以备将来使用。要修饰盖玻片上的胺基团，加入硫辛酸PEG NHS和mPEG NHS，并将培养皿在室温下孵育一小时。在孵育结束时，用水冲洗表面三次。

之后，将100微升0.1摩尔碳酸氢钠加入一组夹心盖玻片中，每毫升含有1毫克磺基-NHS-乙酸酯，并孵育30分钟以进行钝化。向每个盖玻片中加入0.5毫升金纳米颗粒，并在室温下孵育30分钟。孵育后，用水冲洗盖玻片三次。

将黑洞淬灭2链以10比1的比例加入退火的DNA张力探针后，每两个盖玻片加入100微升混合物以制作三明治。小心地将湿的实验室组织球放在远离盖玻片的培养皿中，并用封口膜胶带密封培养皿以防止溶液干燥。之后，用箔纸盖住培养皿，并在四摄氏度下孵育过夜。

第二天，组装成像室，在拧紧成像室时注意防止表面开裂。然后，向成像室中加入0.5至1毫升汉克平衡盐溶液。使用带有100倍物镜的Cy3B通道，在DNA发夹张力探针开始扩散时捕获接种在DNA发夹张力探针上的细胞的荧光信号。

制备100微摩尔非荧光锁定链储备液后，在所需时间点将其添加到成像室中终浓度为一微摩尔的细胞中以存储张力信号并通过移液将其与细胞混合。锁定约10分钟后，获取落射荧光中的延时动画或终点图像，以进行定性张力映射和定量分析。成功的表面呈淡粉红色。

在干净的背景和反射干涉对比显微镜或RICM通道以及Cy3B通道中均匀的荧光强度下，证明了表面的高质量。张力锁定的延时图像表明，由于发夹锁定和信号积累，TCR抗CD3ε和TCR-肽-MHC张力信号均被放大。锁定链记录了从零分钟开始的TCR肽MHCN4的短暂机械拉扯事件，这有助于定量分析，并揭示了类似于免疫突触靶心模式的TCR肽MHC力的独特模式。

每一步，您的意向探针基板制备都需要注意细节并小心处理材料。该技术能够可视化细胞表面与环境相互作用时发生的瞬态分子力，特别是在寻找抗原的免疫细胞中。