该协议提供了两种方法，以动员C.Elegans进行体内钙成像的身体壁肌肉。这种方法可以帮助回答与钙平衡和钙处理有关的问题，以及基因可操作生物体中可访问的突触。该技术可以更好地了解调节肌肉钙平衡的机制，因此，在确定通过钙循环调节影响激发收缩耦合的条件或分子通路方面可以保持重要。
这些方法可以提供对研究领域的洞察，包括但不限于神经生物学、发育生物学和细胞生物学。这些技术可以适应研究各种细胞类型和C.elegans，其他相关的线虫以及丝虫幼虫。这种方法的视觉演示至关重要，因此实验者能够了解解剖技术，并能够准确评估来自正确固定动物的钙瞬变。
首先设置荧光成像显微镜。使用能够以100赫兹进行全帧成像的科学CMOS摄像机，以跟踪钙含量的快速变化。使用在 ImageJ 中运行的微管理器软件控制摄像机采集和 LED 荧光激发。
使用连接到外部开源微控制器板的开源电子平台插件来管理控制荧光激动的外部定时脉冲。要控制计时逻辑，请根据制造商的说明在软件中激活微经理采集协议。使用两个 LED 以蓝光刺激通道罗多普辛并记录 RCaMP 变化。
使用 am LED 激活通道 rhodopsin，峰值入场波长为 470 纳米和带通滤波器，使用峰值入场波长为 594 纳米的 LED 和带通滤波器激发 RCaMP。使用二色光束组合器共同照亮两个 LED 并将光传输到同一条光路。根据手稿方向，使用 TTL 信号控制的固态开关控制 LED 照明的时序，并设置 LED 强度与当前受控负载噪声线性电源，然后将蓝光仿真协议编程到模拟器中。
在此实验中，在仅捕获 RCaMP 荧光两秒钟后打开蓝光模拟，并使用 5 毫秒、2 毫秒的蓝光脉冲（间隔 50 毫秒）来激活通道罗多普辛。如果使用解剖制剂，在低光下执行C.elegans解剖。将动物放在解剖盘中，用硅胶涂层的盖玻片底座，该底座上填充了一毫升钙外细胞溶液，根据手稿指示准备。
使用液体局部皮肤粘合剂与蓝色颜色沿蠕虫的后侧粘合动物。并使用玻璃针沿着胶水和蠕虫界面做一个横向角质切口。使用口腔移液器清除蠕虫腔内内脏，然后粘合动物的角质皮瓣，露出腹腔内侧体壁肌肉进行成像。
如果使用纳米珠制剂，使用蒸馏水制造熔融 5% Agra 溶液，最终体积为 100 毫升。使用巴斯德移液器将一滴熔融-Agra 溶液放在玻璃滑梯上，并立即将第二个玻璃滑轨放在顶部，使用轻轻的压力创建均匀的 Agra 垫。将顶部幻灯片和大约四个微升聚苯乙烯纳米珠到垫中间。
在低光下，在纳米珠溶液中加入四到六个C.elegans，确保动物不会彼此躺在上面，并小心地在上面放置一个盖玻片。准备好成像时，将准备好的幻灯片或解剖盘放在显微镜上，并使用 10 倍的放大倍率和昏暗的明亮场照明找到并聚焦在蠕虫上。在 RCaMP 荧光激发中切换到 60 倍放大，以识别外阴前部和正确的声平面中内侧体壁肌肉。
然后，通过拉出切换并单击数据采集软件中的实时图像路径，将图像路径从目镜更改为相机。单击数据采集软件中的 ORI 按钮，围绕正在关注的肌肉创建一个框。在刺激器上，打开先前编程的蓝光刺激路径，然后单击"获取"成像软件以捕获图像。
当C.elegans生长在全跨视网膜上，成功结合视网膜并激活通道罗多普辛时，可以唤起钙的瞬态。如果动物没有暴露在全跨视网膜没有肌肉钙瞬态被触发。该协议用于研究功能 sca-1 突变体的损失，这些突变体影响由 sca-1 基因编码的沙原体性钙泵。
但是，与对照组相比，在突变体中观察到RCaMP荧光基线水平的解剖制剂增加，这表明突变需要休息细胞质钙水平升高。与对照体相比，sca-1突变体的峰值钙含量显著降低。然而，在上升的高峰时间或半衰减时间没有变化。
重要的是，使用技术上挑战性较低的纳米珠制剂可以观察到类似的结果。评估了破坏钙激活大钾通道的功能慢突变体损失，以调查间接影响C.elegans钙处理的突变体。当测量RCaMP的基线水平时，与对控组相比，突变体显示的荧光增加。
在评估钙瞬态动力学时，未看到峰值钙水平的变化。然而，slo-1（如142）突变体在峰值时间的上升显著增加。完成手术时要记住的最重要的一步是准备全跨视网膜的实验动物。
如果没有此步骤，通道红松素将处于非活动状态，防止引发光诱导钙瞬变。按照这个程序，电生理学和行为分析可以进行评估任何观察到的钙平衡变化的功能影响。使用此处概述的固定化方法，为进一步探索钙动力学铺平了道路，并证明可以使用远没有挑战性的珠固定技术对光遗传学神经元刺激和肌肉钙瞬变捕获进行类似结果的观察。
