使用多参数光伏平台对钙流入和HIV-1感染进行单细胞特征描述

此协议可以在单细胞级别上捕获实时动力学。我们可以测量针对艾滋病毒感染的单个细胞参数，并将早期信号事件与病毒生命周期的延迟步骤联系起来。这是使用新型光伏平台进行单细胞分拣、培养、成像和软件自动化的传统成像方法的集成可扩展替代方案。

这是第一个建立的纳米流体、高通量、纵向单细胞培养和成像方法。该技术可广泛采用，研究各种疾病状态下的细胞信号动力学和动态分子相互作用。这种方法的视觉演示对于传达实验是如何建立的、细胞如何被光学分类成笔以及如何通过芯片进行输液非常重要。

首先，通过将 25 微升 100 倍浓缩洗涤剂溶剂和 2.5 微升 1000X Fluo-4 AM 添加到 1.5 毫升管中，然后将漩涡混合，从而准备新鲜的 Fluo-4 AM 装载解决方案。派珀特 2.5 毫升培养介质进入加载解决方案并倒置混合。在 500 倍 G 下，以 200 万 MT-4 细胞进行离心，然后取出介质，在准备好的 Fluo-4 AM 加载解决方案的两毫升中重新注入颗粒。

派佩特将细胞重新悬浮到35毫米的培养皿中。在37摄氏度下孵育15至30分钟，然后在室温下再孵育15至30分钟。将细胞悬架转移到离心管中，以 500 倍 G 将细胞离心，三分钟，然后去除超母细胞。

通过在培养介质的一毫升中管和离心机在 500 倍 G 中重新注入细胞颗粒，洗涤三分钟。通过在培养介质中以每毫升200万个细胞的浓度对至少50微升的细胞进行管道输送来补充细胞颗粒。要用润湿溶液准备芯片，从而促进细胞笔下，请用新的光伏芯片将含有两毫升润湿溶液和 50 毫升除离子水的离心机管加载到仪器上，并运行湿芯片功能，使芯片充满润湿溶液。

在 50 摄氏度下孵化芯片，用水冲洗芯片三次。冲水完成后，用三个周期的 250 微升培养介质冲洗芯片。在加载前，每 100 个部件 F127 洗涤剂溶解剂中就有一个补充前一步的细胞悬架，以减少细胞粘附在芯片通道上的可能性。

使用仪器导出针从 1.5 毫升离心机管导入细胞，具有负载操作和小批量导入，用于 5 微升电池包体积。使用优化的光电子定位或 OEP 电压为 4.3 伏特和每秒 5 微米的钢笔单元，使用自动笔功能自动检测单个电池，用 OEP 笼环绕它们，并将它们移动到附近的笔中。如果感兴趣的单元格仍然遵循自动笔，请使用手动笔功能选择目标单元格和目标笔。

笔下完成后，用三个周期的 250 微升培养介质冲洗芯片，以清除芯片中剩余的未修复细胞。在写入细胞后，获取 FITC、德克萨斯红和 DAPI 通道中细胞的荧光图像，以测量基线 Fluo-4、mCherry 和自流。通过出口针将悬架慢慢输送到芯片中，将 HIV-1 注入微芯片中，浓度为每 200 万个细胞 13 毫微克的 HIV-1 NLCI。

在加入艾滋病毒-1后，在10分钟的时间内在FITC和DAPI频道反复获取图像。在感染后一天、二天、三天和四天内在德州红色和 DAPI 频道获取图像。这种方法用于通过mCherry测量识别和聚集艾滋病毒感染者和未受感染的细胞。

MCherry信号变化大于或低于4万的细胞平均荧光强度分别聚集在MCherry高或mCherry低种群中。通过在9分钟的时间内反复测量细胞内钙，对钙流入动力学进行分析，证明早期钙在HIV感染细胞中的流入。观察到钙的流入和mCherry花期之间的显著正相关关系。

在尝试此过程时，请记住，从病毒生成和感染的指数增长范围内的细胞开始非常重要，因为过度生长的细胞将导致此检测信号的急剧下降。与艾滋病毒-1合作可能是危险的。因此，在执行此程序时应始终采取 OSHA 血液传播病原体标准中所述的 BSL-2 做法。

这项技术是令人兴奋的，因为它将允许我们研究单细胞表型或转录变化在受控条件下。这对于将刺激对许多细胞类型分子通路的影响联系起来具有广泛的潜力。