这项工作是由卫生部授予R01 HL105734到VVPMDL国家研究院​​赞助支持，部分是由健康研究事业奖K08 HL094748国家机构。 VVP是美国心脏协会的创新研究员被授予11IRG900384支持。

1，准备必要的解决方案和设备<ol><li>首先，通过高压灭菌他们15分钟消毒手术器械（直形镊子，弯形镊子，直板造型剪刀和弯曲的形状剪）。在121℃。准备2台仪器，其中一组用于解剖出来的心和另一组中的将被用于切碎起来的组织。 </li><li>溶解MCDB153培养基1包900毫升的消毒，过滤后的水，搅拌缓慢，直到粉末完全溶解。添加1.2克碳酸氢钠，或毫升钠15.7碳酸氢盐溶液，对于每升培养基的最终体积被制备并进行搅拌直到溶解[w / v的7.5％。将pH调节至7.2，加入任一的1N HCl或1N的NaOH，然后通过在组织培养罩（生物安全柜中）在无菌条件下用0.2微米的瓶顶过滤器倾介质。然后收集媒体，并将其保存在4℃。 </li><li>准备补充添加到培养介质（材料清单）。的补充剂应该被添加到需要的只是在媒体前电镀细胞的培养基。 </li><li>制备DPBS有10％FBS加抗生素（青霉素和链霉素）。 </li><li>至100毫升DPBS加抗生素（青霉素和链霉素）中，接着，通过添加0.25克胰蛋白酶（USB牛胰腺，活动&gt; 2500 USP单位/ mg，超纯水）制备0.25％胰蛋白酶溶液。 </li><li>完成此过程所需的其他必要的设备，包括立体显微镜，培养皿（10厘米），50毫升锥形管，40微米的细胞过滤器，DPBS加用抗生素，60毫米培养皿和35毫米的培养皿。 </li></ol> 2，隔离新生乳鼠心脏<ol><li>首先，获得P0到P2新生乳鼠组（n = 6〜8）。建议使用由养殖DCT的Cre重组酶的女性纯合子雄性是杂无论是R26R产生的幼崽：EYFP的等位基因或Z / EG基因标记的黑素细胞样细胞。这两个R26R：EYFP和Z / EG小鼠可以从杰克逊实验室（股票号码006148和003920，分别）。 </li><li>其次，安乐死的新生小鼠幼崽，用酒精棉签擦拭胸前，然后将幼崽在一个10厘米的培养皿用DPBS。 </li><li>切开皮肤在胸腔和胸骨用灭菌镊子和剪刀，然后打开箱子仔细地在立体显微镜下。新生小鼠幼崽的心是非常小的，所以要小心，以确保与连接心房切除整个心脏。 </li><li>在DPBS洗心，将它们转移到一个新的10厘米的培养皿。 </li></ol> 3，酶消化<ol><li>把培养皿的切心来组织培养罩（生物安全柜），然后按照下面使用无菌技术，在通风橱中的步骤。 </li><li>首先，洗心三次在无菌的DPBS加用抗生素。 </li><li>将心中（N = 6-8）在60毫米的培养皿中，加入6-8毫升的0.5％胰蛋白酶溶液的培养皿中。 </li><li>接着，切割的心成小块（小于1毫米的大小），并在5％CO 2气氛中孵育它们在37℃下进行30分钟。 </li><li>孵育期结束后，倒入所得的心脏组织，并从盘的胰蛋白酶溶液到无菌的50ml锥形管中。 </li><li>然后，用10毫升无菌吸管，快速而轻，磨碎的50毫升锥形管30-50倍的解决方案。 </li><li>过滤通过一个新的，干净的50毫升锥形管的顶端40微米的细胞过滤网，所得溶液以收集滤液。 </li><li>接着，离心50-ml管中，在240×g下在台式离心机，5分钟，在室温下进行。然后，轻轻地吸上清，悬浮颗粒残留在6-8毫升无菌的DPBS。重复此步骤2次以上。这一步小球心房肌细胞和心脏的黑色素细胞，但不会拖垮网络由于成纤维细胞的成纤维细胞体积较小，将保留在上清液中。 </li></ol> 4，电镀黑素细胞心肌样细胞<ol><li>离心后的第三冲洗，小心排出或吸断洗涤液（DPBS），重悬在6ml MCDB培养基的沉淀到该补充剂已被添加。 </li><li>现在，绘制再悬浮液进入无菌移液管，然后将细胞在35毫米的菜，或在6孔板的好，游泳池，距离3新生小鼠离体心肌细胞在一个35毫米的菜或好。 </li><li>孵化菜过夜，在37℃，5％CO 2气氛中，吸脱培养基连同任何未附着的细胞，然后用DPBS冲洗所述板一次。然后加入新鲜培养基，以将板和更换介质每2天。细胞从新生儿或胚胎心脏分离可维持培养达3周，而细胞从成年听到分离TS可被保持在培养长达10天。 </li></ol>从成年小鼠心脏5隔离心黑素细胞样细胞<ol><li>首先，请从成熟老鼠的心（3-4周龄，N = 3）通过给予肝素100单位腹腔注射给小鼠，然后它们实施安乐死后中线胸骨。它建议用戊巴比妥安乐死的小鼠在此过程中，但这种药物是不是在所有地区提供。 </li><li>接下来，洗切心含在组​​织培养罩（生物安全柜）抗生素无菌DPBS。轻轻挤压心脏采用弧形解剖钳去除他们剩余的血液，然后冲洗心中的DPBS一次。 </li><li>从心里卸下心房和房室环（这些结构含有黑素细胞样细胞），然后将切除的组织标本中有35毫米的菜。 </li><li>用弯剪和切割力的心切成小块PS，然后添加6-8毫升的0.5％胰蛋白酶溶液的培养皿中。然后孵育的菜，在37℃，45〜60分钟。 </li><li>现在，遵循的程序上面的步骤从步骤3.6起开始。 </li></ol>

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	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

我们什么都没有透露。

心黑素细胞存在于心脏内的解剖位置中通常引起心律失常的触发器。这些区域包括肺静脉，房室瓣环，后左心房和卵圆孔（ 图4）。要理解中的作用，这些细胞在心律失常玩，我们开发的技术来隔离他们，研究他们的生理机能。但是，我们认识到，提高该技术以产生更健康，更大量的心脏黑色素细胞将允许进一​​步的研究，以探讨心脏黑色素细胞对外源性刺激的反应。此外，改进的...

我们最近发现在表达黑色素合成酶和形态上类似皮肤的黑素细胞的小鼠和人类的心脏了一种新的细胞群。我们称这些细胞的黑素心“，发现他们是存在于解剖位置，从该房性心律失常的触发往往起源于人类。我们还发现心脏黑色素细胞在小鼠生殖细胞缺失的DCT导致房性心律失常。心黑素细胞稀疏地分布在整个小鼠心房，他们包括所有心房细胞少于0.1％。调查心脏黑色素细胞的电特性和生物特性，我们开发了一种方法，从使用Cre重组酶诱导的黑素细胞特异性标记物的小鼠心脏隔离。我们的初始步骤，从那些用于分离新生鼠心肌细胞，并产生非常小的数值适用于膜片钳记录或PCR分析细胞的开发。然而，为了提高愈合日和心脏的黑色素细胞，进行更深入的分析，电生理或生化研究的可行性，我们制定了从那些旨在隔离皮肤的黑素细胞精致的过程。描述和展示了在本次审查的程序有生产，可作为镀纯人群或心肌与心脏健康的黑素细胞的优势。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCDB 153</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M7403</td>
 <td>Dissolve in: Water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, no calcium no magnesium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190136 </td>
 <td>Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S5761 or S8761 </td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140163 </td>
 <td>Stock Conc.: 100X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Life Technology</td>
 <td>Certified</td>
 <td>Working Conc.: 4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TPA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P1585</td>
 <td>DMSO 
 Stock Conc.: 3.2 &mu;M 
 Working Conc.: 32 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transferrin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8158</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.1 mg/ml 
 Working Conc.: 1 &mu;g/ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0627</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.5 mM 
 Working Conc.: 5 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6634</td>
 <td>10 mM 
 acetic acid 
 Stock Conc.: 1 mg/ml 
 Working Conc.: 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basic FGF</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354060</td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 4 ng/&mu;l 
 Working Conc.: 4 ng/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

我们确定了一个新的黑色素细胞样细胞群（也称为心源性黑色素细胞），在小鼠中导致房性心律失常触发小鼠和人类的心。调查心脏黑色素细胞的电特性和生物特性，我们开发了一种程序，从小鼠心脏，我们从这些设计以分离新生鼠心肌细胞衍生的隔离。为了获得适合于更广泛的膜片钳或生化研究健康心脏的黑素细胞，我们开发了一种精制方法分离和镀基于那些最初设计以隔离皮肤黑素细胞中黑素细胞的心脏。精致的过程证明了本次审查，并产生更大的健康黑色素细胞样细胞，可作为镀纯人口或心肌细胞的数量。

在这篇文章中描述的协议是相对于我们以前出版的从小鼠心脏心脏分离黑素细胞之一的改进技术。这个过程采用了利用由黑色素合成酶特异性Cre重组酶从动标注心脏黑色素细胞样细胞的荧光标记物。使用的标记物与新鲜分离的胚胎或新生儿细胞中工作时，由于该区分心脏的黑素细胞从心房肌细胞的形态差异尚未发展（ 图1A）标记心脏的黑素细胞是重要的。 如图1A时，分离...

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Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

在这个协议中，W E 发现了新的黑色素细胞样细胞群（也称为心源性黑色素细胞）的小鼠和人类中，有助于房性心律失常引发小鼠的心。

从小鼠心脏中分离主黑素细胞样细胞

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

isolating-primary-melanocyte-like-cells-from-the-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K 次观看.  University of Pennsylvania. 在这个协议中，W E 发现了新的黑色素细胞样细胞群（也称为心源性黑色素细胞）的小鼠和人类中，有助于房性心律失常引发小鼠的心。 