初级毛质素黑色素细胞和纤维细胞培养的快速生成

该协议描述了一种从小鼠中生成原发性黑色素细胞和成纤维细胞培养的快速而简单的方法。由于此技术不要求表皮和真皮分离，因此只需进行最少的培训，就可以快速、一致地执行。该方法可用于研究皮肤黑色素细胞和成纤维细胞生物学。

在这些培养物中的实验可以提供与癌症、伤口愈合和色素沉着缺陷相关的见解。开始之前，请务必准备所有必要的试剂，并检查水浴的温度。如果计划处理多个样本，请参阅表 1 中的试剂缩放指南。

证明这个程序将是布兰登墨菲，一个研究生从我的实验室。在层流柜中，将每只安乐死小鼠的树干短暂地卷在含有70%乙醇的无菌培养皿中。将鼠标从乙醇中取下，放入空无菌培养皿中。

接下来，用70%乙醇消毒手术剪刀。使用这些剪刀在躯干腹侧的皮肤做切口，从颈部开始，一一继续到尾巴。使用无菌钳子，将皮肤从小鼠的躯干中剥离，并从皮肤的皮侧去除多余的脂肪组织。

将皮肤，真皮侧向下，放入一个六井盘中，含有三毫升1X抗生素抗霉菌溶液。在室温下孵育两到三分钟。然后，打开组织斩波器，将设置调整到此处显示的设置。

安装组织切碎器刀片和操作机器时，请务必小心谨慎。将皮肤，真皮侧向下，转移到无菌组织切碎盘，并通过组织切碎器完全通过三次皮肤。在此之后，将均质皮肤转移到含有三毫升皮肤消化缓冲液的无菌15毫升锥形管中。

使用 P1000 微移液器，通过上下移液 10 到 15 次混合产生的悬浮液。盖锥形管，在37摄氏度的水浴中孵育样品15分钟，确保每三至五分钟倒一次管子。接下来，在室温下以 750 倍 G 的摆动桶转子将管离心 5 分钟，使皮肤中细胞均质。

使用P1000微移液器缓慢而完全去除皮肤消化缓冲液，小心不要干扰颗粒。一定要吸掉所有皮肤消化液。如果你有麻烦，用两到三密耳的黑色素细胞介质清洗细胞颗粒，并重复离心，并去除多余的皮肤消化缓冲液。

然后，使用P1000移液器上下移液15至20次，将细胞颗粒彻底重新在一毫升黑色素细胞介质中重新暂停。将生成的细胞溶液溶液明智地转移到六井中一个未涂覆的井中，该井含有一毫升黑色素细胞介质。在37摄氏度的组织培养箱中用5%的二氧化碳孵育镀层皮肤均质，40分钟。

在此之后，将培养物从未涂覆的盘子转移到预洗的胶原蛋白涂层六井盘的一个井中。将 G-418 添加到介质中，使最终浓度为每毫升 100 毫微克。在现在含有粘附成纤维细胞的未涂层盘中的一个井中加入两毫升的成纤维细胞介质。

在37摄氏度的组织培养箱中用5%的二氧化碳孵化两种培养。经过16至24小时的孵育，分别吸气介质和每种培养物的任何碎片。每次洗涤时，使用一毫升 PBS 清洗每道菜两次。

然后，在黑色素细胞培养中加入两毫升新鲜黑色素细胞介质，并将两毫升新鲜成纤维细胞介质添加到成纤维细胞培养中。在这项研究中，成纤维细胞和黑色素细胞培养物同时从同一皮肤样本生成。当均质皮肤首次镀上时，介质显示为多云。

然而，孵育后较大的细胞联合体和粘附细胞成纤维细胞在培养皿中变得可见。培养中的非粘附细胞被转移到胶原蛋白涂层盘中，并用G-418进行处理。被G-418杀死的成纤维细胞在未来五天内漂浮在黑色素细胞培养基中。

在培养四到五天后，镀黑色素细胞开始具有黑色素颗粒的树突状表型。这种表型在传传时持续存在，而污染角蛋白细胞的簇则丢失。通过流式细胞学确认由此产生的黑色素细胞和成纤维细胞培养物的纯度。

黑色素细胞标记GP100的表达特定于黑色素细胞培养，而成纤维细胞标记FSP1只存在于原发性成纤维细胞中。控制C59角蛋白细胞是角蛋白细胞标记，K14唯一染色阳性的培养物。执行其他分析以确定建立富集的黑色素细胞培养物需要多长时间。

GP100阳性细胞开始出现在第四天，并在培养10天后达到峰值。此过程可用于快速生成黑色素细胞和成纤维细胞培养物，用于各种体外和高通量的验质测定。