Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Award R01 HL105734 zu VVPMDL gelagert ist, zum Teil, von der National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP ist eine innovative Forscher von der American Heart Association von Grant 11IRG900384 unterstützt.

1. Vorbereitung die notwendigen Lösungen und Anlagen <ol><li> Erstens, die chirurgischen Instrumente zu sterilisieren (gerade Form einer Pinzette, gebogene Form einer Pinzette, Schere gerade Form und gekrümmter Form einer Schere) durch Autoklavieren sie für 15 min. bei 121 ° C aufweist. Bereiten Sie 2 Sets von Instrumenten, wo ein Satz zum Präparieren Sie sich die Herzen und den anderen Satz verwendet wird, zum Zerkleinern das Gewebe verwendet werden. </li><li> Lösen Sie 1 Päckchen MCDB153 Kulturmedien in 900 ml sterilisiertem, gefiltertem Wasser und langsam rühren, bis das Pulver aufgelöst hat. Fügen Sie 1,2 g Natriumbicarbonat, oder 15,7 ml Natriumhydrogencarbonat-Lösung [7,5% w / v], für jeden Liter Gesamtvolumen von Medium vorbereitet und rühren bis gelöst. Den pH-Wert auf 7,2 durch Zugabe von entweder 1 N HCl oder 1 N NaOH, dann gießen Sie das Medium durch einen 0,2 um Flasche Top-Filter unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube (Biosicherheitswerkbank). Dann sammeln die Medien und speichern sie bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Ergänzungenin den Kulturmedien (Materialliste). Die Zuschläge sollen die Medien unmittelbar vor der Datenträger für die Plattierung der Zellen benötigt hinzugefügt werden. </li><li> Vorbereitung DPBS mit 10% FBS und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). </li><li> Als nächstes bereiten 0,25% Trypsin-Lösung durch Zugabe von 0,25 g Trypsin (Rinderpankreas, Aktivität&gt; 2500 USP Einheiten / mg, hochreines, USB) und 100 ml DPBS und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). </li><li> Weitere benötigte Ausrüstung benötigt, um dieses Verfahren abschließen gehören ein Stereomikroskop, Petrischalen (10 cm), 50 ml konischen Röhrchen, 40-um-Zelle Siebe, DPBS sowie Antibiotika, 60-mm-Kulturschalen und 35-mm-Kulturschalen. </li></ol> 2. Trenn Herzen von Neugeborenen Maus Pups <ol><li> Erstens erhalten P0 bis P2 neonatalen Maus Jungtieren (n = 6 bis 8). Es wird empfohlen, Welpen durch Züchtung Dct-Cre homozygote Weibchen mit Männchen, die heterozygot für entweder die R26R erzeugt verwenden: EYFP Allel oder der Z / EG-Allel, das EtikettMelanozyten-ähnlichen Zellen. Sowohl R26R: EYFP und Z / EG Mäuse sind von Jackson Laboratories (Lager Zahlen 006.148 und 003.920, beziehungsweise). </li><li> Als nächstes einschläfern der Neugeborenen-Maus Welpen, wischen ihre Brust mit einem Alkoholtupfer und legen Sie dann die Welpen in einer 10 cm Petrischale mit DPBS. </li><li> Schneiden Sie die Haut über der Brust und das Brustbein mit sterilisierten Pinzette und Schere und öffnen Sie dann die Brust sorgfältig unter einem Stereomikroskop. Die Herzen der neonatalen Maus Welpen sind sehr klein, so vorsichtig sein, um sicherzustellen, dass die gesamte Herz mit den Vorhöfen angebracht entfernen. </li><li> In DPBS waschen die Herzen und übertragen Sie sie auf einem neuen 10-cm-Petrischale. </li></ol> 3. enzymatische Verdauung <ol><li> Bringen Sie die Petrischale mit den ausgeschnittenen Herzen, um eine Gewebekultur Kapuze (Biosicherheitswerkbank) und folgen Sie dann die folgenden Schritte unter Verwendung von sterilen Techniken in der Kapuze. </li><li> Zunächst dreimal waschen die Herzen in sterilen DPBS und Antibiotika. </li><li> Legen Sie die Herzen (n = 6-8) in ein60-mm-Kulturschale und fügen 6-8 ml 0,5% Trypsin-Lösung in die Schale. </li><li> Weiter schneiden die Herzen in kleine Stücke (von weniger als 1 mm in der Größe) und inkubieren bei 37 ° C für 30 min in einer 5% CO 2 Atmosphäre. </li><li> Nach der Inkubationszeit beendet ist, gieße die resultierende Lösung von Herzgewebe und Trypsin von der Schale in eine sterile 50-ml konischen Röhrchen. </li><li> Dann, mit einem 10-ml sterile Pipette, schnell, aber sanft, verreiben Sie die Lösung in der 50-ml konischen Röhrchen 30-50 mal. </li><li> Filtern der resultierenden Lösung durch ein 40 um-Sieb Zelle auf einem neuen, sauberen 50 ml konischen Röhrchen, um das Filtrat zu sammeln. </li><li> Weiter Zentrifugation der 50-ml-Röhrchen bei 240 x g in einer Tischzentrifuge 5 min bei Raumtemperatur. Dann vorsichtig den Überstand absaugen und Pellet resuspendieren übrigen in 6-8 ml steriler DPBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. Dieser Schritt Holzpellets die Vorhofmyozyten und Herz Melanozyten aber nicht bringen den fiDa Fibroblasten Fibroblasten sind kleiner und werden im Überstand verbleiben. </li></ol> 4. Auflage Herz Melanozyten-ähnlichen Zellen <ol><li> Nach der dritten Spülung nach der Zentrifugation vorsichtig ablassen oder absaugen der Waschlösung (DPBS) und das Pellet in 6 ml MCDB Kulturmedien, denen die Ergänzungen wurden hinzugefügt. </li><li> Nun ziehen die resuspendierten Lösung in einem sterilen Transferpipette und legen Sie die Zellen in einer 35-mm-Schale oder in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, und bündeln die isolierten Herzzellen von neugeborenen Mäusen 3 in einem 35-mm-Schale oder auch. </li><li> Geschirr Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre, absaugen dem Kulturmedium zusammen mit allen anhaftende Zellen und dann die Platten einmal gründlich mit DPBS. Dann fügen Sie frisches Medium zu den Platten und ersetzen die Medien alle 2 Tage. Zellen, die aus embryonalen oder neonatalen Herzen isoliert in Kultur für bis zu 3 Wochen beibehalten werden, während Zellen aus erwachsenen hören isoliertts in Kultur für bis zu 10 Tage gehalten werden. </li></ol> 5. Trennherz Melanozyten-ähnlichen Zellen aus adulten Maus Herz <ol><li> Entfernen Sie zunächst die Herzen von reifen Mäuse (3-4 Wochen alt, n = 3) durch eine Mittellinie Sternotomie nach Verabreichung von Heparin 100 U intraperitoneale den Mäusen und dann euthanizing ihnen. Es wird empfohlen, Pentobarbital verwenden, um Mäuse für dieses Verfahren einschläfern, aber dieses Medikament ist nicht an allen Standorten verfügbar. </li><li> Nächsten, waschen Sie die ausgeschnitten Herzen in sterilen DPBS Antibiotika enthalten in einer Gewebekultur Haube (Biosicherheitswerkbank). Drücken Sie die Herzen leicht mit geschwungenen Dissektionszangen, um alle verbleibenden Blut aus ihnen zu entfernen und dann spülen Sie die Herzen in DPBS noch einmal. </li><li> Entfernen Sie den Vorhöfen und AV-Ringraum von den Herzen (diese Strukturen enthalten die Melanozyten-ähnlichen Zellen) und legen Sie die ausgeschnittenen Gewebeproben in einem 35-mm-Schale. </li><li> Schneiden Sie die Herzen in kleine Stücke mit einer gebogenen Schere und Kraftps und fügen 6-8 ml 0,5% Trypsin-Lösung in die Schale. Dann brüten die Gerichte bei 37 ° C für 45-60 min. </li><li> Nun führen Sie die Schritte aus dem oben beschriebenen Verfahren ab Schritt 3.6 ab. </li></ol>

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	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Herz Melanozyten sind in anatomischen Stellen innerhalb des Herzens, die häufig Anlass zu Vorhofarrhythmie Trigger vorhanden. Diese Regionen umfassen die Lungenvenen, den atrioventrikulären Annulus, das hintere linke Atrium und das Foramen ovale (Abbildung 4). Um die Rolle dieser Zellen in Arrhythmogenese spielen verstehen, entwickeln wir Techniken, um sie zu isolieren und studieren ihre Physiologie. Jedoch haben wir erkannt, daß eine Verbesserung dieser Technik ergeben gesünder und größeren Menge...

Wir haben vor kurzem identifiziert eine neuartige Zellpopulation im Herzen von Mäusen und Menschen, die Melanin-Synthese Enzyme zu exprimieren und morphologisch ähneln kutanen Melanozyten. Wir als &quot;Herz Melanozyten&quot; Diese Zellen und fanden sie in anatomischen Stellen, an denen Vorhofarrhythmie löst häufig bei Menschen stammen vorhanden sind. Wir fanden auch, Herz Melanozyten dazu beitragen, Vorhofrhythmusstörungen bei Mäusen mit Keimbahn Löschung von DCT. Herz Melanozyten dünn gesamten Maus Vorhof, wo sie weniger als 0,1% aller atrialen Zellen umfassen verteilt. Um die elektrischen und biologischen Eigenschaften von Herz Melanozyten untersuchen wir ein Verfahren, um sie von der Maus mit Herz Cre-induzierbare Melanozyten spezifische Marker zu isolieren entwickelt. Unsere ersten Verfahren wurde von denen zur neonatalen Kardiomyozyten murinen und ergab sehr kleine Zahl von geeigneten für Patch-Clamp-Aufnahmen oder PCR-Analyse entwickelt, Zellen zu isolieren. Jedoch zur Verbesserung der heilenten und die Lebensfähigkeit von Herz Melanozyten, für tiefer gehende Analyse elektrophysiologische oder biochemische Studien entwickelten wir ein verfeinertes Verfahren entwickelt, um von den Melanozyten der Haut zu isolieren. Die beschriebene und in diesem Beitrag gezeigt, Vorgehensweise hat den Vorteil, gesündere Herz Melanozyten, die als reine Population oder mit Kardiomyozyten beschichtet werden können.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCDB 153</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M7403</td>
 <td>Dissolve in: Water</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS, no calcium no magnesium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190136 </td>
 <td>Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S5761 or S8761 </td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 1X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140163 </td>
 <td>Stock Conc.: 100X 
 Working Conc.: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum</td>
 <td>Life Technology</td>
 <td>Certified</td>
 <td>Working Conc.: 4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TPA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P1585</td>
 <td>DMSO 
 Stock Conc.: 3.2 &mu;M 
 Working Conc.: 32 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transferrin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8158</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.1 mg/ml 
 Working Conc.: 1 &mu;g/ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0627</td>
 <td>DPBS 
 Stock Conc.: 0.5 mM 
 Working Conc.: 5 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6634</td>
 <td>10 mM 
 acetic acid 
 Stock Conc.: 1 mg/ml 
 Working Conc.: 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Basic FGF</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354060</td>
 <td>Water 
 Stock Conc.: 4 ng/&mu;l 
 Working Conc.: 4 ng/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

Wir identifizierten eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen Trigger in Mäusen bei. Um die elektrischen und biologischen Eigenschaften von Herz Melanozyten untersuchen wir ein Verfahren, um sie von Mäuseherzen, die wir von denen zur neonatalen Kardiomyozyten Maus zu isolieren abgeleitet isolieren entwickelt. Um gesünder Herz Melanozyten geeignet für umfangreichere Patch-Clamp-oder biochemische Untersuchungen zu erhalten, ein raffiniertes Verfahren entwickelt, die wir für die Isolierung und Beschichtung Herz Melanozyten basierend auf den ursprünglich entwickelt, um Haut-Melanozyten zu isolieren. Die raffinierte Vorgehensweise wird in diesem Beitrag gezeigt und produziert eine größere Anzahl von gesunden Melanozyten-ähnlichen Zellen, die als reine Population oder mit Kardiomyozyten beschichtet werden können.

Die in diesem Artikel beschriebene Protokoll ist eine verbesserte Technik im Vergleich zu der, die wir zuvor für die Isolierung Herz Melanozyten von murinen Herz veröffentlicht. Dieses Verfahren setzt die Verwendung von Fluoreszenzmarkern durch Melaninsynthese enzymspezifische Cre-Rekombinase angetriebenen Herz Melanozyten-ähnlichen Zellen zu markieren. Es ist wichtig, um einen Marker zu verwenden, um Herz Melanozyten Etikett beim Arbeiten mit frisch isolierten embryonalen oder neonataler Zellen, da die morphologisch...

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Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

In diesem Protokoll w e identifiziert eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen löst bei Mäusen bei.

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

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