所有作者均参与对所提出的方法的建立和验证，以及稿件的草案。

所有动物实验过程中的协议遵循慕尼黑工业大学，德国的动物护理指引。 1，媒体/提取物的制备<ol><li>组织同质化 组织同质化的质量对后续检测神经可塑型变化在培养神经元的关键。在这里，均化，建议使组织解离没有在组织中的温度上升大。 <ol><li>直接从-80℃至液氮并将其放置在组织中的均化的固相的胰腺组织的转帐5 x 5毫米×5毫米的立方体。理想的均化将解离组织的速度不够快，不让它解冻。 </li><li>立即离解后，重新悬浮固体，粉末状的匀浆在300-500微升0.1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。在这里，不使用任何裂解液（如RIPA），因为这可能会裂解神经元。</li><li>离心匀浆至少15分钟，你的板凳离心机（ 如 21,130 XG）的最高速度。收集上清液它代表了组织提取液。 </li></ol></li><li>细胞上清液<ol><li>让所关注的细胞达到至少70 - 在正常生长培养基中80％汇合。 </li><li>通常情况下，这些媒体包括血清成分，并可能在神经元的生长产生不可控制的影响。因此，在达到所需的细胞密度后，用细胞培养级的PBS洗细胞，至少3倍，并放置在无血清培养基（SFM），长达48小时。 注意：在此，考虑到某些细胞（象胰腺星状细胞）可能需要血清中的生长培养基中，以维持其正常状态和结构。在这种情况下，为了找到所需的完整细胞函数的可能的最低血清内容执行在所感兴趣的细胞的培养基系列血清稀释Ñ​​。 </li><li>测量通过Bradford蛋白测定的组织匀浆或细胞上清液中的蛋白质浓度。虽然这些值的变化取决于组织和细胞类型，胰腺组织提取物，应有5-12微克/微升之间的浓度范围内，并且为3-8微克/微升之间的细胞系上清液。 </li></ol></li></ol> 2，分装提取物和细胞上清液这取决于在该测定中使用的浓度，在神经元培养基中的提取物或上清液的终浓度应为100微克/毫升5,8。 注意：对于与神经元的生长于500μl培养基中在24孔板的每个孔中的测定法，需要50微克蛋白质从各提取物或上清，每孔。在约10微克/微升的典型提取物浓度，人们可能需要5微升提取物/上层清液的每个孔。在每一个设置搜索克为一式三份，这将对应到15微升提取物/上清。对于不同的组织或细胞类型，执行最后的提取物或上清液浓度的连续稀释和比较不同提取物/上清浓度之间所观察到的神经营养作用。 神经元3。隔离一旦提取物/上清收集完成后，继续与神经元的隔离。 <ol><li>对于DRG神经元，收集颈椎腰椎日龄（P）2-12后斩首和背根神经节的显微立体解剖（ 图1A）之间的新生大鼠背根神经节。为了有足够的DRG神经元的24孔板，收集所有颈椎腰椎一名新生儿鼠（相当于52 DRG）每盘的DRG。 <ol><li>切去周边（神经）和背根神经节的中央突起（根）由microscissors的手段。 离开突起的地方阻碍了研制和增加T他文化的污染风险由成纤维细胞。 </li></ol></li><li>对于MP神经元，切离小肠和手动肠系膜，小心剥离小肠（关于MP隔离一个详细的协议，是指舍费尔等人 9， 图1B）的浆肌层。对于MP，收集来自两个大鼠每24孔板的神经丛。 注：尝试，因为它们妨碍其从小肠成功分离，是尽可能轻柔，以免眼泪在浆肌层。 </li><li>收集用庆大霉素（20毫克500ml中培养基）和甲硝唑（在500ml培养基中2.5毫克）供给在冰冷的极限必需培养基中背根神经节和浆肌层（MEM）。 </li><li>以下收集DRG的，它们孵育在Hank平衡盐溶液（HBSS），用胶原酶II型20-30分钟供给。用于MP隔离，孵育1-3小时之间胶原酶类型，取决于年龄的动物（ 图1C）。 </li><li>对于MP，根据收集的立体网状MP件，转移到冰冷的MEM。 </li><li>然后通过注射器磨碎的DRG和MP与直径减小。 注意：过度研磨会破坏神经元，但少了神经胶质细胞。 </li><li>一旦包含背根神经节或MP介质已经变得浑浊，离心93.9×g离心5分钟暂停，弃去培养基，重悬在Neurobasal培养基（含100 U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素，0.5mM的L-谷氨酰胺和2％的B-27）。 </li><li>通过血球的方式计数细胞总数（ 即神经元和神经胶质细胞）。 注意：需要的细胞的数目是依赖于测量的参数。对轴突密度的定量化，需要更密集的培养物，从而更大数量的细胞比对神经突向外生长，perikaryonal尺寸的测量和分支单个神经元的形态。对于轴突密度测量， 例如使用10,000个细胞（神经胶质细胞+）/孔或1,500神经元/孔。对于形态上的单个神经元细胞的短暂（1分钟长），胰蛋白酶消化和2500个细胞/孔或400神经元/播种和建议。从一个大鼠获得的细胞的典型产率为约300,000-500,000细胞。 </li><li>种子细胞在其上已涂覆前的夜晚13毫米盖玻片和顶部的井用Neurobasal培养基（补充有100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，0.5mM的L-谷氨酰胺和2％的B-27）（ 图1D）。 注意：使用聚-D-赖氨酸（40毫克/米2）或鸟氨酸和层粘连蛋白包被的（1毫克/毫升每个）涂布盖玻片。细胞附着到聚-D-赖氨酸非常快，从而使其适用于实验中，都需要许多细胞（ 即轴突密度测量）。附件粘连一般是一些什么较弱，但层粘连蛋白是神经突向外生长的强启动子。因此，对神经元的分支和神经突长度的测量，比较喜欢鸟氨酸/层粘连蛋白涂层。 </li><li>使细胞附着到孔中过夜。在第二天，制备提取物的培养基中（在最终提取物/上层清液的100微克/毫升的浓度）。 </li><li>吸出接种培养基，并用PBS进行可选的，非常温和洗涤，然后慢慢地吸取提取物/上清液的培养基中（ 图1E）。 </li><li>让细胞生长48小时。吸媒体和4％多聚甲醛免疫染色（ 图1F）修复。 </li><li>用神经元特异性（ 如 β-III-微管蛋白）和神经胶质特异性（ 如胶质fibriallary酸性蛋白/ GFAP）标记（ 图1G）进行双免疫荧光染色。 </li><li>对于形态，使用倒置光显微镜配备结合无线CCD摄像机TH自动化的软件，它允许轴突密度测量（见表）。 </li><li>神经细胞的轴突密度从最密集的增长对每个盖玻片4个不同地区按覆盖50微米×50微米的网格，计算在交叉纤维测定每平方的纤维密度测量4-5个代表性显微照片200倍的放大倍率。神经突向外生长，平均每神经元分支的数目，平均分支长度和perikaryonal大小可以从每个盖玻片随机选择30孤神经元标记的轴突和胞体（ 图1H）进行测定。 </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

作者没有竞争的利益，没有财务披露。

本协议的目的是为了说明这是最近开发的由我们小组研究神经可塑性的机制，在前列腺癌和CP 5 体外胰腺神经可塑性试验背后的方法论。该协议涉及它可以很容易地被应用一次表演已经获得了在DRG和MP神经元的分离和培养足够的经验，进行为期三天的过程。此外，它表示用于学习和肠溶DRG相关神经胶质细胞的胰腺微环境组分的伴随反应的有价值的工具。 <p clas...

在胃肠道（GI）的神经形态和密度的改变已经引起胃肠病学家和病理学家的关注很长一段时间，但其对胃肠道疾病的病理生理学意义尚不清楚1-3。事实上，有几个非常常见的胃肠道疾病如胃炎，反流性食管炎，结肠炎，憩室炎，阑尾炎都在发炎的组织方面1增加神经分布密度有关。然而，没有真正注意到目前为止已支付给在胃肠道的机制和神经可塑性的含义。别形态学改变的胃肠道神经从正常胃肠道神经不同， 即肠神经系统的正常状态下，在其功能方面？什么是塑料肠神经改变神经肽/神经递质含量的影响？请问周边神经可塑性总是意味着改变信号的中枢神经系统？哪里有塑料extri的中央预测NSIC胃肠神经通路？当看着我们的知识对胃肠道神经可塑性的功能方面的缺乏可以很容易地生成一个长等一系列关键问题。 胃肠道神经可塑性在功能层面的研究需要有效，重复性好，仍然很容易适用的实验模型。在增加的时代普及和接受遗传工程有条件的小鼠模型（GECoMM），这种在体内设置的承受阐明胃肠道神经可塑性的以前未知的方面在一个现实的方式1的潜力。然而，GECoMM的设计和生产仍是昂贵的，劳动密集的，尤其是费时。此外，他们还要求先验选择要有条件地调制在基因改变小鼠（ 如转基因的肠上皮细胞神经生长因子/神经生长因子过度表达）的目标。因此，对于DES一个成功的GECoMM的IGN，研究人员需要一种有价值的目标的一些指标（ 如以前的实验数据）， 即该利益（这里NGF）的分子至少可以预期会对胃肠神经生物学的一些相关影响。 这些指标可以很容易地衍生自适当的体外模型，其中从体内系统的复杂的微环境中分离的细胞的亚型可以在异型方式4-7被选择性地共培养。在这样的异型文化背景的分子靶点的调制平均为技术上不太繁琐，速度更快，因此可以在有价值的目标的预滤波有助于验证在体内研究。 最近，我们提出这是设计来模拟胰内NE的增加神经密度和肥大的体外神经可塑性试验rves人胰腺癌癌（PCa）和慢性胰腺炎（CP）的组织。在这里，从新生大鼠背根神经节（DRG）或肌间神经丛（MP），得出的神经元是从手术切除的前列腺癌或CP组织标本暴露于组织提取物和相比，那些在正常人体胰腺（NP）组织提取物5培养。而不是组织提取物，还可以使用细胞上清液来研究神经可塑性选择的细胞类型的影响。当一个标准化的形态测量相结合，所提出的神经可塑性试验允许有效的和可重复的神经可塑性的评估针对不同的胰腺微环境。特别地，它允许1）形态学神经可塑性的仿真， 即变化的神经突向外生长，分支图案和神经元的大小，和2）功能性神经可塑性， 即在改变外周神经元的兴奋性。此外，不仅外围（ 即 </em&gt;肠溶），但也中央（ 例如背根神经节或二阶脊髓）的神经元可被包括在本试验以评估其形态和功能的反应，不同的GI组织内容。在本视频教程中，我们展示了技术协议，这个实验的性能，并讨论其优点和缺点。此外，我们提醒大家注意这种试验，以神经可塑性的任何胃肠器官研究的基本概念的适用性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

神经可塑性是病理条件下的肠神经系统和胃肠道（GI）的神经支配的固有特征。然而，神经可塑性的胃肠道疾病的病理生理作用尚不清楚。新颖的实验模型允许模拟和胃肠道神经可塑性的调制可以使得的神经可塑性的，尤其胃肠疾病，如胰癌（PCa）和慢性胰腺炎（CP）的贡献增强的赞赏。在这里，我们提出了一个协议，用于模拟在体外利用新生大鼠背根神经节（DRG）和肌间神经丛（MP），神经元的条件下胰腺神经可塑性的。这种双神经元的方法不仅允许监控两个器官内在的和，外在神经可塑性，同时也代表一种有价值的工具来评估神经元和神经胶质细胞形态学及电生理学。此外，它允许提供的微环境内容的功能调节学习他们的IMPACt关于神经可塑性。一旦建立，目前神经可塑性试验承担的是适用于神经可塑性的任何胃肠器官研究的潜力。

形态神经可塑性 在新生大鼠（P2-12）和播种密度的表示年龄范围，MP和DRG神经元48小时（ 图2A）后，已经建立密集的神经网络。神经元培养于前列腺，CP之间的轴突密度，和NP提取物的比较揭示了背根神经节神经元中前列腺癌或CP提取物的更大的轴突密度比NP提取物（ 图2A）5。我们特别喜欢MP神经元上的单个神经元的测量，因为MP神经元往...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

神经元可塑性是一个日益认识到，但是不能充分理解的胃肠（GI）道的特征。这里，在人胰腺疾病的实例中，我们提出了对神经元可塑性的在胃肠道中在两个形态和功能水平的研究在体外神经可塑性试验。

模拟胰腺神经可塑性：<em&gt;体外</em&gt;双神经元可塑性分析

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

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Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K 次观看.  Technische Universität München. 神经元可塑性是一个日益认识到，但是不能充分理解的胃肠（GI）道的特征。这里，在人胰腺疾病的实例中，我们提出了对神经元可塑性的在胃肠道中在两个形态和功能水平的研究在体外神经可塑性试验。 