모든 저자가 제시 한 분석의 설립 및 검증으로하고 원고의 초안에 기여했다.

프로토콜의 모든 동물 실험 절차는 TECHNISCHE Universität 뮌헨, 독일의 동물 관리 지침을 따르십시오. 1. 미디어 / 준비를 추출 <ol><li> 조직의 균질화 조직 균질의 품질은 배양 된 뉴런 neuroplastic 변경의 결과 탐지에 매우 중요합니다. 여기서, 균질화는 조직의 온도에 큰 증가없이 조직의 분리를 가능하게하는 것이 좋습니다. <ol><li> 전송 5mm × 5 ㎜ × 5 ㎜의 직접 조직 homogenator에서 고체 상태에서 액체 질소와 장소에 -80 ° C에서 췌장 조직의 큐브. 이상적인 homogenator는 녹이다를 허용하지 않고, 충분히 빨리 조직을 떼어 놓다 것입니다. </li><li> 즉시 분리 후, 0.1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 300-500 μL에서 고체 분말 형상의 파쇄를 재현 탁. 여기,이 신경 세포를 용해 수 있기 때문에 (예 : RIPA 같은) 용해 버퍼를 사용하지 않습니다.</li><li> 벤치 원심 분리기 (예 : 21,130 XG)의 최대 속도로 적어도 15 분 동안 균질화를 원심 분리기. 조직 추출물을 나타내는 맑은 상층 액을 수집합니다. </li></ol></li><li> 세포주 상층 액 <ol><li> 정상적인 성장 매체에 80 %의 합류 - 관심의 세포가 적어도 70에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 이러한 미디어는 혈청 성분을 포함하고 신경 세포의 성장에 따라 통제 할 수없는 효과를 발휘할 수있다. 따라서, 원하는 세포 밀도에 도달 한 후, 세포 배양 등급 PBS로 최소한 3 배 당신의 세포를 세척하고 최대 48 시간 동안 무 혈청 배지 (SFM)에 배치합니다. 참고 : 여기에, (췌장 성상 세포와 같은) 일부 세포가 정상 상태와 구조를 유지하기 위해 자신의 성장 배지에 혈청을해야 할 수도 있음을 고려해야합니다. 그러한 경우에, 본래 세포 능의 필요한 최저 혈중 콘텐츠를 찾기 위해 그 셀의 직렬 혈청 배지에서의 희석을 수행N. </li><li> 브래드 포드 단백질 분석을 통해 조직 균질 액 또는 세포 상층 액의 단백질 농도를 측정한다. 이러한 값이 조직 및 세포 종류에 따라 다르지만, 췌장 조직 추출물에 대해, 하나는 5-12 ㎍ / μL 사이의 농도 범위를 예상하고, 3-8 ㎍ / μL 사이 세포주 상청액위한 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 나누어지는 추출물과 세포의 상층 액 분석에 사용되는 농도에 따라 신경원 매체 추출물 또는 상등액에 최종 농도가 100 ㎍ / ㎖의 5,8이어야한다. 참고 : 신경 세포는 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 배지에서 성장 분석을 위해, 하나는 잘마다 각각의 추출물 또는 상층 액의 단백질 50 μg을 필요로한다. 약 10 ㎍ / μL의 전형적인 추출물의 농도로, 하나는 각 웰에 대한 추출 / 상층 액의 5 μl를해야합니다. 각을 맞춘다에서G 세중으로 수행,이 추출물 / 상층 액 15 μL에 해당하는 것입니다. 다른 조직이나 세포 유형의 경우, 최종 추출물 또는 상층 액 농도의 시리얼 희석을 수행하고 다른 추출물 / 상층 액의 농도 사이의 관찰 된 신경 영양 효과를 비교. 뉴런의 3. 분리 추출 / 상층 액을 수집이 완료되면, 신경 세포의 분리와 함께 계속한다. <ol><li> DRG 뉴런의 경우, 생후 (P) 2-12 잘린 및 DRG의 stereomicroscopic 해부 (그림 1A) 후 사이에 태어난 쥐의 DRG를 허리에 자궁 경부를 수집합니다. , 24 - 웰 플레이트에 충분한 DRG 뉴런이 접시 당 (52 DRG를 동등) 한 신생아 쥐의 DRG를 허리 모든 자궁 경부를 수집하기 위해. <ol><li> microscissors에 의해 주변 장치 (신경) 및 DRG의 중앙 돌출부 (뿌리)을 버려야. 장소에 돌기를두면 분쇄을 방해하고 T를 증가그는 섬유 아 세포에 의해 문화의 위험을 오염. </li></ol></li><li> MP 뉴런의 경우, 수동으로 소장과의 장간막을 버려야 조심스럽게 소장 (MP 격리에 대한 자세한 프로토콜, 샤퍼 등. 9 그림 1B 참조)의 seromuscular 층을 벗겨. MP를 들어, 24 잘 플레이트 당 두 쥐의 신경 얼기를 수집합니다. 참고 : 그들은 소장에서 성공적인 분리를 방해하기 때문에 seromuscular 층에서 눈물을 방지하기 위해 될 수있는 한 부드럽게 대하기 위해보십시오. </li><li> 겐타 마이신 (500ml의 배지에서 20 ㎎) 및 metronidazol (500 ㎖의 중간에있는 2.5 mg)을 함께 제공 얼음처럼 차가운 최소한의 필수적인 매체에서 DRG와 seromuscular 층 (MEM)를 수집합니다. </li><li> DRG의 모음에 따라, 20 ~ 30 분 동안 콜라게나 유형 II와 함께 제공 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에서 그들을 품어. MP 격리를 들어, 연령에 따라 1 ~ 3 시간 사이에 콜라게나 유형에 품어동물 (그림 1C)의. </li><li> MP의 경우, 실체 현미경 그물코 형상 MP 조각들을 수집하고 빙냉 MEM으로 옮긴다. </li><li> 그런 다음 직경 감소와 주사기를 통해 DRG와 MP를 씹다. 참고 : 과도한 분쇄가 신경을 파괴, 그러나 더 적은 아교 세포 수 있습니다. </li><li> DRG 또는 MP를 포함하는 매체가 5 분 93.9 XG에서 정지 흐림, 원심 분리가되면, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.5의 L-글루타민에게 보충 Neurobasal 매체의 중간에 resuspend을 (폐기 2 % B-27). </li><li> 혈구에 의해 셀의 총 개수 (즉, AND 신경 아교)를 센다. 주 : 필요한 세포의 수가 측정 파라미터에 의존한다. 신경 돌기 밀도의 정량, 신경 돌기는 한 가지, perikaryonal 사이즈의 측정보다 밀도 배양함으로써 세포의 더 많은 수를 필요개별 뉴런의 패턴을 분기. 신경 돌기의 밀도 측정의 경우, 예를 들어 잘 10,000 세포 (신경 세포 + 아교) / 또는 1,500 뉴런 / 잘 사용합니다. 개별 뉴런, 짧은 (1 분 길이) 세포의 trypsination 2,500 세포 / 웰 또는 400 뉴런 /의 파종에 대한 형태 학적 잘 좋습니다. 한 쥐에서 얻은 세포의 전형적인 수율은 약 300,000-500,000 세포입니다. </li><li> 전날 밤에 코팅 된 13mm 커버 슬립에 세포를 씨앗과 (100 U / ㎖ 페니실린과 보충, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.5 mM의 L-글루타민 2 % B-27) Neurobasal 매체 (그림에게로 우물을 위로 1D). 참고 : 사용 폴리 - D - 라이신 (40 ㎎ / 평방 미터) 또는 오르니 틴과 라미닌 코팅 된 코팅 (1 ㎎ / ㎖ 각) 커버 전표. 세포는 이렇게 많은 세포 불필요되는 실험 (즉 신경 돌기 밀도 측정)에 적합하다, 매우 빠른 폴리-D-라이신에 부착. 라미닌에 첨부 파일은 일반적으로 몇 가지에약한 것을하지만, 라미닌은 신경 돌기 가지의 강력한 프로모터이다. 따라서, 신경 분지와 신경 돌기의 길이에 대한 측정을 위해, 오르니 틴 / 라미닌 코팅을 선호한다. </li><li> 세포는 하룻밤 우물에 부착 할 수 있습니다. 다음 날, (100 ㎍ / ㎖의 최종 추출물 / 상층 액 농도) 추출물이 첨가 된 미디어를 준비합니다. </li><li> 시드 매체를 대기음하고 PBS로 선택, 매우 부드러운 세척을 수행 한 다음 천천히 추출 / 상층 액을 보충 된 미디어 (그림 1E)를 피펫. </li><li> 세포는 48 시간 동안 성장하자. 미디어를 대기음 (그림 1 층) 면역 염색을 위해 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. </li><li> 신경 세포의 특정 (예 : 베타 III-튜 불린)과 glia의 별 (예 : 아교 fibriallary 산성 단백질 / GFAP) 마커 (그림 1G)를 사용하여 이중 면역 형광 염색을 수행합니다. </li><li> 형태 학적 들어, 콤비네이션 위스콘신에서 CCD 카메라가 장착 도립 광학 현미경을 사용신경 돌기의 밀도를 측정 할 수 자동화 소프트웨어 (표 참조) 번째. </li><li> 의 연결을 문화의 신경 돌기의 밀도는 50 ㎛ × 50 ㎛의 격자를 중첩시키고 교차 섬유 측정 단위 면적당 섬유 밀도를 계산하여 각 coverslip에 대한 밀도 높은 성장의 4 가지 영역에서 200 배 배율에서 4-5 대표 현미경에서 측정됩니다. 신경 돌기의 가지, 신경 세포 당 가지 수를 의미, 평균 분기 길이 perikaryonal 크기는 신경 돌기 및 perikarya (그림 1H)를 표시하여 각 coverslip에에서 무작위로 선택된 30 고독한 뉴런에서 측정 할 수있다. </li></ol>

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	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

저자는 더 경쟁의 관심과 재정적 공시가 없습니다.

본 프로토콜은 최근 PCA와 CP 5에 신경 가소성의 메커니즘을 연구하기 위해 우리의 그룹에 의해 개발 된 생체 췌장 신경 가소성 분석 뒤에 방법론을 설명하기위한 것입니다. 프로토콜은 연기자가 DRG와 MP 신경 세포의 분리 및 문화에 충분한 경험을 쌓았되면 쉽게 적용 할 수있는 세 가지 일의 절차를 포함한다. 또한, 췌장 미세 환경의 구성 요소에 장내 및 DRG 관련 아교의 수반하는 반?...

위장 (GI) 신경의 형태와 밀도의 변화는 오랜 시간 동안 소화기 및 병리학의 관심을 끌었했지만, 위장관 질환의 병태 생리에 대한 자신의 관련성은 1-3 알려지지 않았다. 실제로, 위염, 역류성 식도염, 대장염, 게실염, 충수염과 같은 몇 가지 매우 일반적인 위장 장애는 염증 조직 분야 1 증가 신경 분포 밀도와 연관되어 있습니다. 그러나, 진짜 관심은 지금까지 위장관의 메커니즘과 신경 가소성의 의미에 지불되지 않았다. 형태 학적으로 변형 된 GI의 신경은 그 기능의 측면에서, 장용 신경계의 정상 상태, 즉 정상 GI 신경과 다를합니까? 플라스틱 장내 신경의 변경된 신경 펩타이드 / 신경 전달 물질의 내용의 의미는 무엇입니까? 말초 신경 가소성은 항상 중앙 신경 시스템에 변경된 신호를 수반 하는가? 어디 플라스틱 extri의 중심 돌기는NSIC GI의 신경 경로? GI의 신경 가소성의 기능적 측면에 대한 우리의 지식의 소수를 볼 때와 같은 핵심 질문의 긴 시리즈를 쉽게 생성 할 수 있습니다. 기능 수준에서 위장관 신경 가소성의 연구는, 유효한 재현 여전히 쉽게 적용 할 수있는 실험 모델을 필요로한다. 증가의 시대에 인기와 같은 생체 설정에서 유전자 조작 조건부 마우스 모델 (GECoMM)의 수용은 실제 패션 1 GI의 신경 가소성의 이전에 알려지지 않은 측면을 명료하게 할 수있는 잠재력을 부담. 그러나 GECoMM의 설계 및 제조는 비용이 많이 드는 노동 집약적 유지하고, 특히, 시간이 많이 소요. 또한, 그들은 조건부 유전자 조작 마우스 (장내 상피 세포에서 신경 성장 인자 / NGF의 예를 들면 유전자 과발현) 변조 할 대상의 사전 선택이 필요합니다. 따라서, DES에 대한성공적인 GECoMM의 IGN이 연구원은 가치있는 목표의 몇 가지 지표 (예를 들어, 이전의 실험 데이터)가 필요합니다 (여기 NGF) 그 분자가 적어도 GI 신경에 대한 몇 가지 생물학적으로 중요한 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다 즉. 이러한 지표들은 쉽게 생체 시스템의 복잡한 미세 환경으로부터 격리 세포 아형 선택적 이형 방식 4-7 공 배양 할 수있는 시험 관내 모델에서 적절한로부터 유도 될 수있다. 이러한 이형 문화 환경에서 분자 표적의 변조는 빠르고, 평균 기술적으로 덜 복잡하고, 따라서 생체 내 연구의 검증을 위해 가치있는 대상의 사전 필터링에 도움이 될 수 있습니다. 최근에, 우리는 intrapancreatic NE의 증가 된 신경 밀도와 비대를 시뮬레이션하기 위해 설계되었습니다 체외 신경 가소성의 분석을 제시인간의 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP) 조직에서 rves. 여기에, 신생아 쥐의 척수 신경절 (DRG) 또는 myenteric 신경총 (MP)에서 파생 된 신경 외과 적 절제 PCA 또는 CP 조직 표본에서 조직 추출물에 노출 정상적인 인간의 췌장 (NP) 조직 추출물 5 배양에 비해했다. 대신 조직 추출물 번 또한 신경 가소성의 선택된 세포 유형의 영향을 연구하기 위하여 세포주 상층 액을 사용할 수있다. 표준화 된 형태 계측 학적 측정과 함께 사용하면되게 신경 가소성의 분석은 다른 췌장 미세 환경에 대한 응답으로 신경 가소성의 유효하고 재현성 평가를 할 수 있습니다. 특히, 허용하는 신경 돌기의 가지, 패턴 및 신경 크기 분기, 2) 기능 신경 가소성, 말초 신경의 흥분에, 즉 변화의 변화 즉, 1) 형태 학적 신경 가소성의 시뮬레이션. 또한, 주변뿐만 아니라 (즉, </em&gt; 장용성)뿐만 아니라, 중심부 (예 DRG 또는 2 차 척추) 신경은 여러 GI 조직 내용에 그들의 형태 학적 및 기능적 반응을 평가하기 위해, 본 분석에 포함시킬 수있다. 본 비디오 튜토리얼에서, 우리는이 분석의 성능에 대한 기술적 인 프로토콜을 설명하고 그 장점과 단점에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 GI 기관의 신경 가소성의 연구에이 분석의 기본 개념의 적용에 관심을 그립니다.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Ornithine/laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2533/L4544</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Coverslips</td><td>Merck</td><td></td><td>For use in 24-well plates</td></tr><tr><td>Dismembranator S</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-III-tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1637</td><td>1:200 concentration</td></tr><tr><td>Anti-GFAP-antibody</td><td>DAKO</td><td>M0761</td><td>1:400 concentration</td></tr><tr><td>RIPA buffer + protease inhibitor</td><td></td><td></td><td>Any supplier</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>17504044</td><td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td></tr><tr><td>Gentamicin/Metronidazol</td><td></td><td></td><td>Any supplier</td></tr><tr><td>Minimal essential medium</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>24020133</td><td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLS-2</td><td>Obtain lots with at least 200 U/mg activity</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td>Any supplier</td></tr><tr><td>analySIS docu software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

신경 가소성은 병적 인 조건에서 장용 신경계와 위장관 (GI) 신경 분포의 고유 기능입니다. 그러나 GI 장애의 신경 가소성의 병태 생리 학적 역할은 알려지지 않았다. 시뮬레이션 및 GI의 신경 가소성의 조절을 허용 새로운 실험 모델은 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP)과 같은 특정 위장관 질환에서 신경 가소성의 기여의 강화 된 감사를 가능하게 할 수있다. 여기, 우리는 신생아 쥐의 척수 신경절 (DRG)와 myenteric 신경총 (MP) 신경 세포를 사용하여 생체 조건에서 췌장 신경 가소성의 시뮬레이션을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 이중 신경 세포의 접근 방식은 두 기관의 내장과 - 외인성 신경 가소성의 모니터링을 허용뿐만 아니라, 신경 세포와 신경 교세포의 형태 및 전기 생리학을 평가하는 유용한 도구를 나타냅니다뿐만 아니라. 또한, 자신의 IMPAC 공부를 위해 공급되는 미세 내용의 기능 조절을 할 수 있습니다신경 가소성에 t. 일단 설정되면, 본 신경 가소성 분석은 GI 기관의 신경 가소성의 연구에 적용 할 수 있다는 가능성을 맺는다.

형태 학적 신경 가소성 갓 태어난 쥐 (P2-12) 및 파종 밀도의 표시 연령 범위에서, MP 및 DRG 뉴런은 이미 48 시간 (그림 2A) 이후 밀도의 연결 네트워크를 구축 할 수 있습니다. PCA, CP에서 재배 뉴런 사이의 신경 돌기의 밀도, NP 추출물의 비교 NP 추출물에 비해 PCA 또는 CP 추출물의 DRG 뉴런의 큰 신경 돌기의 밀도 (그림 2A) 5를 보여준다. MP 뉴?...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

신경 가소성은 위장 (GI) 요로의 점점 인식하지만, 충분히 이해 기능입니다. 여기, 인간의 췌장 질환의 예에서, 우리는 형태 학적 및 기능적 수준에서 위장관의 신경 가소성 연구를위한 생체 외 신경 가소성의 분석을 제시한다.

췌장 신경 가소성 시뮬레이션 :<em&gt; 체외</em&gt; 이중 신경 가소성 분석

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K 조회수.  Technische Universität München.  신경 가소성은 위장 (GI) 요로의 점점 인식하지만, 충분히 이해 기능입니다. 여기, 인간의 췌장 질환의 예에서, 우리는 형태 학적 및 기능적 수준에서 위장관의 신경 가소성 연구를위한 생체 외 신경 가소성의 분석을 제시한다. 

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

연구

발생학

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

생물학

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

신경과학

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) pathophysiology in vitro. Multi-electrode array (MEA) recordings are a means to record electrical field potentials from large populations of neurons and analyze network activity over time. It was previously demonstrated that the presence of hiPSC-A that are differentiated using techniques to promote a spinal cord astrocyte phenotype improved maturation and electrophysiological activity of regionally specific spinal cord hiPSC-motor neurons (MN) when compared to those cultured without hiPSC-A or in the presence of rodent astrocytes. Described here is a method to co-culture spinal cord hiPSC-A with hiPSC-MN and record electrophysiological activity using MEA recordings. While the differentiation protocols described here are particular to astrocytes and neurons that are regionally specific to the spinal cord, the co-culturing platform can be applied to astrocytes and neurons differentiated with techniques specific to other fates, including cortical hiPSC-A and hiPSC-N. These protocols aim to provide an electrophysiological assay to inform about glia-neuron interactions and provide a platform for testing drugs with therapeutic potential in ALS.

We describe a method for differentiating spinal cord human induced pluripotent-derived astrocytes and neurons and their co-culture for electrophysiological recording.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

HD-MEA에 대한 멀티모달 대규모 신경 기록 및 분석 

Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from patterns of spatiotemporal neuronal activity. These dynamic patterns emerging from functional groups of interconnected neuronal ensembles facilitate precise computations for processing and coding multiscale neural information, thereby driving higher brain functions. To probe the computational principles of neural dynamics underlying this complexity and investigate the multiscale impact of biological processes in health and disease, large-scale simultaneous recordings have become instrumental. Here, a high-density microelectrode array (HD-MEA) is employed to study two modalities of neural dynamics - hippocampal and olfactory bulb circuits from ex-vivo mouse brain slices and neuronal networks from in-vitro cell cultures of human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The HD-MEA platform, with 4096 microelectrodes, enables non-invasive, multi-site, label-free recordings of extracellular firing patterns from thousands of neuronal ensembles simultaneously at high spatiotemporal resolution. This approach allows the characterization of several electrophysiological network-wide features, including single/-multi-unit spiking activity patterns and local field potential oscillations. To scrutinize these multidimensional neural data, we have developed several computational tools incorporating machine learning algorithms, automatic event detection and classification, graph theory, and other advanced analyses. By supplementing these computational pipelines with this platform, we provide a methodology for studying the large, multiscale, and multimodal dynamics from cell assemblies to networks. This can potentially advance our understanding of complex brain functions and cognitive processes in health and disease. Commitment to open science and insights into large-scale computational neural dynamics could enhance brain-inspired modeling, neuromorphic computing, and neural learning algorithms. Furthermore, understanding the underlying mechanisms of impaired large-scale neural computations and their interconnected microcircuit dynamics could lead to the identification of specific biomarkers, paving the way for more accurate diagnostic tools and targeted therapies for neurological disorders.

저자 스포트라이트: HD-MEA 기술을 통한 대규모 신경 역학 발전

Here, we employ HD-MEA to delve into computational dynamics of large-scale neuronal ensembles, particularly in hippocampal, olfactory bulb circuits, and human neuronal networks. Capturing spatiotemporal activity, combined with computational tools, provides insights into neuronal ensemble complexity. The method enhances understanding of brain functions, potentially identifying biomarkers and treatments for neurological disorders.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from ...

In Vitro Modeling of Down Syndrome Neurogenesis Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Down syndrome (DS), caused by an extra copy of chromosome 21, is a leading cause of intellectual disability. One of the key factors contributing to this intellectual disability is impaired neurogenesis observed from fetal stages onwards. To study these neurodevelopmental abnormalities, human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) generated using cells obtained from DS patients provide a valuable and relevant model. Here, a comprehensive protocol is described for recapitulating DS-impaired neurogenesis observed during DS fetal stages. This protocol utilizes a pair of DS-hiPSCs having three copies of chromosome 21 and its isogenic euploid hiPSCs having two copies of chromosome 21. Importantly, the protocol described here recapitulates DS-impaired neurogenesis and found that biphasic cell cycle defect, i.e., reduced proliferation of DS neural progenitor cells (NPC) during the early phase of the neurogenic stage followed by increased proliferation of DS NPC during the late phase of the neurogenic stage is the cause of DS impaired neurogenesis. Increased proliferation of DS NPC during the late phase of the neurogenic stage leads to delayed exit from the cell cycle, causing reduced generation of post-mitotic neurons from DS NPCs. This protocol includes detailed steps for the maintenance of hiPSCs, their differentiation into neural lineages displaying biphasic cell cycle defect during the neurogenic stage, and the subsequent validation of reduced neural differentiation in DS cells. By following this methodology, researchers can create a robust experimental system that mimics the neurodevelopmental conditions of DS, enabling them to explore the specific alterations in brain development caused by trisomy 21.

This protocol outlines a methodology for recapitulating Down syndrome (DS) impaired neurogenesis using DS human iPSCs. The protocol identified biphasic cell cycle defect as the cause of impaired neurogenesis in Down syndrome. It provides a robust platform for understanding cellular and molecular mechanisms underlying the abnormal neurogenesis associated with DS.

체외(In Vitro ) Modeling of Down Syndrome Neurogenesis Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Down syndrome (DS), caused by an extra copy of chromosome 21, is a leading cause of intellectual disability. One of the key factors contributing to this ...

췌장 신경 가소성 시뮬레이션 :

요약

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공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

위한 시스템

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

체외(In Vitro ) Modeling of Down Syndrome Neurogenesis Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells