כל המחברים תרמו להקמת והאימות של assay הציג ולטיוטה של ​​כתב היד.

כל הליכי הניסוי בבעלי החיים בפרוטוקול לעקוב אחר הנחיות הטיפול בבעלי החיים של Technische Universität München, גרמניה. 1. מדיה / חלץ ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון רקמה האיכות של הומוגניזציה הרקמה היא קריטית לאיתור הבא של שינויי neuroplastic בנוירונים בתרבית. הנה, homogenizer מומלץ המאפשר ניתוק רקמות ללא עלייה משמעותית בטמפרטורת הרקמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ קוביות של רקמת לבלב ישירות מ-80 מעלות צלזיוס לחנקן נוזלי ומקום בשלב מוצק בhomogenator הרקמות. Homogenator האידיאלי יהיה לנתק את הרקמה מספיק מהר, מבלי שמאפשרים לו defreeze. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ניתוק, resuspend homogenate המוצק, כמו האבקה ב300-500 μl של פוספט שנאגרו מלוח 0.1x (PBS). הנה, לא להשתמש בכל מאגר תמוגה (כגון ריפה) שכן דבר עלול lyse הנוירונים.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenates לפחות 15 דקות במהירות מקסימלית של צנטריפוגות הספסל (למשל 21,130 XG). לאסוף את supernatant ברור המייצג את תמצית הרקמות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants שורת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים של עניין להגיע לפחות 70-80 מפגש% במדיום גידול רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, תקשורת אלה מכיל מרכיבי סרום ויכולה להפעיל את השפעה בלתי נשלטת על צמיחה עצבית. לכן, לאחר שהגיע לצפיפות התאים הרצוי, לשטוף התאים שלך לפחות 3x עם הכיתה תרבית תאי PBS ולמקם אותם במדיום סרום ללא (SFM) עד 48 שעה. הערה: הנה, קח בחשבון שחלק מתאים (כמו תאי stellate לבלב) ייתכן שיהיו צורך בסרום בתקשורת הצמיחה שלהם על מנת לשמור על המצב הרגיל שלהם ומבנה. במקרים כאלה, לבצע דילולים סידוריים סרום במדיום של התא של עניין כדי למצוא התוכן הנמוך ביותר אפשרי הסרום הדרוש לfunctio תא ללא פגעn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון של homogenate הרקמה או supernatants תא באמצעות assay החלבון ברדפורד. בעוד ערכים אלה משתנים בהתאם לסוג הרקמות ותאים, לתמציות רקמת לבלב, הייתי מצפה טווח ריכוז בין 5-12 מיקרוגרם / μl, ולsupernatants שורת תאים בין 3-8 מיקרוגרם / μl. </li></ol></li></ol> 2. תמציות Aliquot וSupernatants הסלולרי בהתאם לריכוז לשימוש בassay, הריכוז הסופי של התמצית או supernatant במדיום העצבי צריך להיות 100 מיקרוגרם / מיליליטר 5,8. הערה: לקבלת assay עם הנוירונים גדל ב500 בינוני μl בבאר כל צלחת 24 גם, צריך 50 מיקרוגרם של חלבון מתמצית או supernatant לכל טוב. בריכוז תמצית אופייני של כ 10 מיקרוגרם / μl, אחד היה צריך 5 μl של התמצית / supernatant לכל אחד. בכל settinגרם שבוצע כשלושה עותקים, זה היה מתאימות ל15 μl של התמצית / supernatant. לסוגים שונים של רקמות או תאים, לבצע דילולים סדרתי של התמצית הסופית או ריכוז supernatant ולהשוות את השפעות נוירוטרופי שנצפו בין ריכוזי התמצית / supernatant השונים. 3. בידוד של נוירונים ברגע שאוסף התמצית / supernatant הוא סיים, להמשיך עם בידוד של נוירונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, לאסוף את צוואר הרחם להמותני DRG של חולדות שזה עתה נולדו בין יום לידה (P) 2-12 לאחר (איור 1 א) עריפת הראש ונתיחת stereomicroscopic של DRG. על מנת לקבל נוירונים DRG מספיק לצלחת 24 גם, לאסוף את כל צוואר הרחם להמותני DRG של עכברוש יילוד אחד (שווה 52 DRG) לכל צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור מהפריפריה (עצבי) ותחזיות מרכזיות (שורשים) של DRG באמצעות microscissors. עוזב את התחזיות במקום פוגע בטחינה דקה ומגביר tהוא זיהום סיכון של תרבות על ידי fibroblasts. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים מגה פיקסל, לחתוך את לפדר מהמעי הדק וידני ולפשוט בזהירות את שכבת seromuscular של המעי דק (לפרוטוקול מפורט על בידוד MP, עיין שפר et al. 9, איור 1). לחבר פרלמנט, לאסוף מקלעת משתי חולדות ל24 גם צלחת. הערה: נסה להיות עדין ככל האפשר על מנת למנוע קרעים בשכבת seromuscular שכן הם פוגעים הפרדה המוצלחת שלה מהמעי הדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את DRG ושכבת seromuscular במדיום חיוני מינימאלי קר כקרח (MEM) מסופק עם גנטמיצין (20mg במדיום 500ml) וmetronidazol (2.5 מ&quot;ג ב500 בינוני מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אוסף של DRG, דגירתם בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) מסופקת עם סוג collagenase השני של 20-30 דקות. לבידוד MP, דגירה בסוג collagenase בין 1-3 HR, בהתאם לגילושל בעל החיים (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחבר פרלמנט, לאסוף את חלקי MP דמוי רשת תחת סטראו ולהעביר לממ קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז triturate DRG ו MP באמצעות מזרקים עם ירידה בקוטר. הערה: טחינה דקה מוגזמת יכולה להרוס את תאי העצב, אבל פחות תאי גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת הבינוני מכיל DRG או MP הפכה מעונן, צנטריפוגה את ההשעיה ב93.9 XG במשך 5 דקות, להשליך בינוני ו resuspend במדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, L-גלוטמין 0.5mm ו -2% ב-27). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של תאים (כלומר תאי עצב וגליה) באמצעות hemocytometer. שים לב: מספר התאים הדרושים תלוי בפרמטר המדידה. לכימות של צפיפות neurite, צריך תרבויות צפופות יותר ולכן מספר גדול יותר של תאים מאשר למדידת תולדת neurite, גודל perikaryonalוהסתעפות דפוס של נוירונים בודדים. עבור מדידות צפיפות neurite, השתמש למשל 10,000 תאים (תא עצב + גליה) / טוב או 1,500 תאי עצב / כן. לmorphometry על נוירונים בודדים, trypsination קצר (באורך דקה-1) של תאים וזריעה של 2,500 תאים / טוב או 400 נוירונים / גם מומלץ. התשואה האופיינית לתאים המתקבלים מעכברוש אחד לא בסביבה 300,000-500,000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים ביום 13 בcoverslips מ&quot;מ אשר היו מצופים בלילה שלפני ולמעלה בארות עם מדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 0.5 מ&quot;מ L-גלוטמין ו -2% ב-27) (איור 1D). הערה: השימוש בפולי-D-ליזין (40 מ&quot;ג / מ 2) או ornithine-ומכסה מחליק (1 מ&quot;ג / מיליליטר כל אחד) מצופה מצופה laminin. תאים לצרף לפולי-D-ליזין מאוד מהר, ובכך הופכים אותו מתאים לניסויים שבהם יש צורך בתאים רבים (מדידות צפיפות neurite כלומר). קובץ מצורף לlaminin הוא בחלק כללימה חלש יותר, אבל laminin הוא אמרגן חזק של תולדת neurite. לכן, מדידות על הסתעפות עצבית ואורך neurite, מעדיף ornithine / laminin ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף לבארות לילה. ביום למחרת, להכין את מדיה בתוספת התמצית (בריכוז התמצית / supernatant סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום הזריעה, ולבצע שטיפה אופציונלית, מאוד עדינה עם PBS, ולאחר מכן פיפטה התמצית / מדיה בתוספת supernatant (איור 1E) באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול במשך 48 שעות. לשאוב את התקשורת ולתקן paraformaldehyde 4% לimmunostaining (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים כפול immunofluorescence באמצעות נוירון ספציפי (למשל בטא III-טובולין) וגליה ספציפית (לדוגמא: גליה fibriallary חלבון חומצי / GFAP) סמנים (איור 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לmorphometry, השתמש מיקרוסקופ אור הפוכה מצוידת במצלמת CCD בwi שילובה תוכנה אוטומטית המאפשרת מדידה של צפיפות neurite (ראה טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות neurite של תרבויות עצביות נמדדת על 4-5 photomicrographs הנציג ב200x הגדלה מ4 אזורים שונים של הצמיחה הצפופה ביותר על כל coverslip ידי שכיסה 50 מיקרומטר x 50 רשת מיקרומטר וסופר את צפיפות סיבים לכל מ&quot;ר שנמדדה בסיבים מצטלבים. התוצאה neurite, אומר מספר סניפים לכל נוירון, אורך הסניף הממוצע וגודל perikaryonal ניתן למדוד מ30 נוירונים בודדים שנבחרו באקראי מכל coverslip על ידי סימון neurites וperikarya (איור 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים מתחרים ואין גילויים פיננסיים.

הפרוטוקול הנוכחי נועד כדי להמחיש את המתודולוגיה מאחורי assay neuroplasticity הלבלב במבחנה אשר פותח לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו כדי ללמוד את המכניזם של neuroplasticity בPCA וCP 5. הפרוטוקול כרוך בהליך של שלושה ימים אשר יכול בקלות להיות מיושם ברגע שהשחקן צבר מספיק ניסיון בבידוד ...

שינויים במורפולוגיה במערכת העיכול (GI) עצב וצפיפות תפסו את תשומת הלב של גסטרואנטרולוגים ופתולוגים במשך זמן רב, אבל הרלוונטיות שלהם להפתופיזיולוגיה של מחלות במערכת העיכול אינן ידועות 1-3. ואכן, כמה הפרעות במערכת העיכול נפוצות מאוד כגון דלקת קיבה, ושט ריפלוקס, דלקת המעי הגס, דלקת, ודלקת תוספתן קשורות עם צפיפות עצבוב מוגברת באזורי רקמה דלקתיים 1. עם זאת, לא שמו לב אמיתי עד כה שילם למנגנונים והמשמעות של neuroplasticity במערכת העיכול. האם עצבים במערכת העיכול מורפולוגית שינו שונים מעצבים במערכת העיכול נורמלים, כלומר המצב הנורמלי של מערכת העצבים enteric, במונחים של תפקידם? מהן ההשלכות של תוכן נוירופפטידים / הנוירוטרנסמיטר שינו בעצבי enteric פלסטיק? האם neuroplasticity ההיקפי תמיד כרוך איתות שינתה למערכת העצבים המרכזית? ואיפה התחזיות של extri פלסטיק המרכזיותמסלולים עצביים במערכת העיכול NSIC? סדרה ארוכה של שאלות מפתח כגון בקלות יכולה להיות שנוצרה כשמסתכלת על המחסור בידע שלנו על ההיבטים הפונקציונליים של neuroplasticity במערכת העיכול. המחקר של neuroplasticity GI ברמה תפקודית דורש מודלים ניסיוניים בתוקף, לשחזור ועדיין ישימים בקלות. בעידן של הגדלת פופולריות וקבלה של מודלים מהונדסים גנטי מותנים עכבר (GECoMM), כגון בהגדרות vivo לשאת את הפוטנציאל להבהיר היבטים ידועים קודם לכן של neuroplasticity GI בצורה מציאותית 1. עם זאת, העיצוב והייצור של GECoMM נשאר יקרים, עתיר עבודה, ובמיוחד בזמן אכילה. יתר על כן, הם דורשים בחירה מראש של היעד להיות מווסת על תנאי בעכבר עבר שינוי הגנטי (ביטוי יתר למשל מהונדס של גורם גדילה העצבי / NGF בתאי האפיתל enteric). לפיכך, עבור desIGN של GECoMM מוצלח, חוקרים צריכים כמה אינדיקטורים (למשל נתוני ניסוי קודמים) של יעד כדאי, כלומר, שהמולקולה של עניין (כאן NGF) יכולה לפחות להיות צפויה להפעיל לכמה תופעות רלוונטיות מבחינה ביולוגית על עצבים במערכת העיכול. בקלות ניתן לגזור אינדיקטורים כגון מנאותים במודלים של מבחנה שבה תת תא מבודד מmicroenvironment המורכב של מערכת vivo בניתן cocultured סלקטיבי באופן heterotypic 4-7. האפנון של מטרות מולקולריות בהגדרת תרבות heterotypic כזה הוא בממוצע מבחינה טכנית מסורבל פחות, מהיר יותר, ולכן יכול לסייע בprefiltering מטרות כדאיות עבור אימות במחקרי vivo. לאחרונה, הצגנו במבחנה assay neuroplasticity שנועד לדמות את הצפיפות המוגברת עצבית והיפרטרופיה של ne intrapancreaticrves בסרטן לבלב אנושי (PCA) ודלקת לבלב כרוני רקמות (CP). הנה, הנוירונים הנגזרים מגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) או מקלעת myenteric (MP) נחשפו לתמציות רקמה מPCA כריתה בניתוח או CP דגימות רקמות והשוואה לאלה בתרבית בלבלב אנושי נורמלי (NP) תמציות רקמה 5. במקום תמציות רקמה, אפשר גם להשתמש supernatants שורת התאים לחקור את ההשפעה של סוגי תאים שנבחרו על neuroplasticity. בשילוב עם מדידת morphometric סטנדרטית, assay neuroplasticity הציג מאפשר הערכה תקפה ושחזור של פלסטיות עצבית בתגובה לmicroenvironments לבלב שונה. במיוחד, היא מאפשרת הסימולציה של 1) neuroplasticity מורפולוגי, כלומר השינויים בתולדת neurite, הסתעפות דפוס וגודל עצבי, ו2) neuroplasticity הפונקציונלי, כלומר שינויים ברגישות של תאי עצב היקפיים. יתר על כן, לא רק פריפריה (כלומר </em&gt; Enteric), אלא גם מרכזי (כגון: DRG או בעמוד השדרה צו שני) יכולים להיכלל הנוירונים בassay ההווה כדי לבחון את התגובה מורפולוגיים ופונקציונלית שלהם לתכני רקמות במערכת העיכול שונים. בוידאו של מורה בהווה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול הטכני לביצוע assay זה ולדון ביתרונות והחסרונות שלה. יתר על כן, אנו מפנים את תשומת לב לתחולתו של הרעיון הבסיסי של assay זה ללימוד neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Neuroplasticity הוא תכונה טבועה בעצבוב המערכת ומערכת עיכול (GI) העצבים enteric תחת מצבים פתולוגיים. עם זאת, תפקיד pathophysiological של neuroplasticity בהפרעות במערכת העיכול נותר עלום. מודלים ניסיוניים חדשניים המאפשרים סימולציה ואפנון של neuroplasticity GI עשויים לאפשר הערכה משופרת של התרומה של neuroplasticity במחלות במערכת העיכול מסוימים, כגון סרטן לבלב (PCA) ודלקת לבלב כרוני (CP). כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימולציה של neuroplasticity לבלב תחת במבחנה תנאי שימוש בגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) ומקלעת myenteric הנוירונים (MP). גישה הכפולה נוירון זה מאפשר לא רק ניטור של שני neuroplasticity האיברים פנימיים וחיצוניים, אלא גם מהווה כלי רב ערך כדי להעריך עצבי ומורפולוגיה ואלקטרופיזיולוגיה גליה. יתר על כן, היא מאפשרת אפנון תפקודי של תוכן microenvironmental סיפק ללימוד Impacלא על neuroplasticity. ברגע שהוקם, assay neuroplasticity הנוכחי נושא את הפוטנציאל להיות ישים לחקר neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.

neuroplasticity מורפולוגיים בטווח הגילים שצוין של חולדות שזה עתה נולדו (P2-12) וצפיפות הזריעה, הנוירונים MP וDRG כבר לבנות רשתות עצביות צפופות לאחר 48 שעה (איור 2 א). השוואה של צפיפות neurite בין הנוירונים טיפחו בPCA, CP, ותמציות NP מגלה צ?...

Watch this Scientific Journal Video about Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay at JoVE.com

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K Views.  Technische Universität München.  פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית. 

Video: Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

פיתוח של סביבת משחקים וירטואלית אודיו מבוססות המסייע במיומנויות ניווט בליינד

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

מודל Murine של חוט השדרה הצווארי פגיעה לחקר פוסט lesional הנשימה Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

יישום של End-to-end השקה ב Pancreatectomy המרכזית רובוטית

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...