ساهمت جميع المؤلفين نحو إنشاء والتحقق من صحة مقايسة المطروحة ومشروع للمخطوطة.

اتباع جميع الإجراءات التجريبية الحيوانية في البروتوكول المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة ميونخ التقني، ألمانيا. 1. الإعلام / استخراج إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة التجانس نوعية تجانس الأنسجة أمر بالغ الأهمية لكشف اللاحقة من التعديلات المرونة العصبية في الخلايا العصبية مثقف. هنا، ينصح الخالط التي تمكن تفارق الأنسجة من دون زيادة كبيرة في درجة حرارة الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 5 مم × 5 مم × 5 مم مكعبات من نسيج البنكرياس مباشرة من -80 درجة مئوية إلى النيتروجين السائل ومكان في المرحلة الصلبة في homogenator الأنسجة. ان homogenator مثالية فصل الأنسجة بسرعة كافية، دون السماح لها defreeze. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التفكك، resuspend والصلبة، مثل مسحوق جناسة في 300-500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة 0.1X (PBS). هنا، لا تستخدم أي تحلل العازلة (مثل RIPA) لأن هذا قد ليز الخلايا العصبية.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في الخليط لمدة 15 دقيقة على الأقل في أقصى سرعة من أجهزة الطرد المركزي الخاصة بك مقاعد البدلاء (على سبيل المثال 21،130 x ج). جمع طاف واضحة والذي يمثل استخراج الأنسجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants خط الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا الفائدة تصل إلى 70 على الأقل - 80٪ التقاء في وسط النمو الطبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة، هذه الوسائط تحتوي على مكونات المصل وربما يؤدي الى تأثيرات لا يمكن السيطرة عليها على نمو الخلايا العصبية. لذلك، بعد أن وصلت كثافة الخلية المطلوبة، وغسل الخلايا الخاصة بك على الأقل 3X مع خلية ثقافة الصف PBS ووضعها في المصل خالية المتوسطة (SFM) لمدة تصل إلى 48 ساعة. ملاحظة: وهنا، نعتبر أن بعض الخلايا (مثل الخلايا النجمية البنكرياس) قد تحتاج المصل في وسائل الإعلام نموها من أجل الحفاظ على حالتها الطبيعية والبنية. في مثل هذه الحالات، نفذ التخفيفات التسلسلي في مصل المتوسطة من الخلية من الفائدة من أجل العثور على أدنى محتوى المصل ممكن اللازمة لfunctio خلية سليمةن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز البروتين من جناسة الأنسجة أو الخلايا supernatants عبر برادفورد فحص البروتين. في حين أن هذه القيم تختلف تبعا لنوع الأنسجة والخلايا، لمقتطفات الأنسجة البنكرياس، يتوقع المرء أن مجموعة تركيز بين 5-12 ميكروغرام / ميكرولتر، وsupernatants خط الخلية بين 3-8 ميكروغرام / ميكرولتر. </li></ol></li></ol> 2. قسامة مقتطفات وSupernatants الخليوي اعتمادا على تركيز لاستخدامها في الفحص، يجب أن يكون تركيز النهائي من استخراج أو طاف في المتوسط ​​العصبية 100 ميكروغرام / مل 5،8. ملاحظة: للحصول على مقايسة مع الخلايا العصبية المتزايدة في 500 ميكرولتر المتوسطة في كل بئر من 24 لوحة جيدا، ويحتاج المرء 50 ميكروغرام من البروتين من كل مستخلص أو طاف لكل بئر. عند تركيز مستخلص نموذجية من حوالي 10 ميكروغرام / ميكرولتر، فإن المرء بحاجة إلى 5 ميكرولتر من استخراج / طاف لكل بئر. في كل settinز يؤديها باعتبارها ثلاث نسخ، وهذا يتوافق مع 15 ميكرولتر من استخراج / طاف. لأنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة، نفذ التخفيفات التسلسلي للمستخلص النهائي أو تركيز طاف ومقارنة آثار عصبية وحظ بين مختلف تركيزات استخراج / طاف. 3. عزل الخلايا العصبية بمجرد الانتهاء من جمع استخراج / طاف، الاستمرار في عزل الخلايا العصبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لDRG الخلايا العصبية، وجمع عنق الرحم لقطني DRG من الفئران حديثي الولادة بين يوم ما بعد الولادة (P) 2-12 بعد قطع الرأس وتشريح stereomicroscopic من DRG (الشكل 1A). من أجل الحصول على الخلايا العصبية DRG كافية ل24 لوحة جيدا، وجمع كل عنق الرحم لقطني DRG أحد الفئران حديثي الولادة (ما يعادل 52 DRG) لكل لوحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعيدا الطرفية (العصبية) والتوقعات المركزية (الجذور) من DRG عن طريق microscissors. ترك التوقعات في مكان يعوق سحن ويزيد رانه خطر التلوث الثقافة عن طريق الخلايا الليفية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالخلايا العصبية MP، قطع بعيدا مساريق من الأمعاء الدقيقة ويدويا وبعناية تجريد قبالة طبقة الطبقتين المصلية و العضلية للأمعاء الدقيقة (عن بروتوكول مفصلة عن النائب العزلة، والرجوع إلى شيفر وآخرون. 9، الشكل 1B). لMP، جمع ضفيرة من اثنين من الفئران في 24 لوحة جيدا. ملاحظة: حاول أن تكون لطيف ممكن من أجل تجنب الدموع في طبقة الطبقتين المصلية و العضلية لأنها تعرقل فصل ناجحة في الفترة من الأمعاء الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع DRG وطبقة الطبقتين المصلية و العضلية في الجليد الباردة الحد الأدنى من المتوسط ​​الأساسية (MEM) المتوفرة مع الجنتاميسين (حجز 20mg في المتوسط ​​500ML) وmetronidazol (2.5 ملغ في 500 مل متوسطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع DRG، واحتضان لهم في محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) المتوفرة مع كولاجيناز النوع الثاني لمدة 20-30 دقيقة. لMP العزلة، واحتضان في نوع كولاجيناز بين 1-3 ساعة، وهذا يتوقف على عمرمن الحيوان (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لMP، جمع مثل صافي النائب قطعة تحت stereomicroscope ونقل إلى MEM الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يسحن على DRG والنائب من خلال الحقن مع تناقص القطر. ملاحظة: سحن المفرط يمكن أن تدمر الخلايا العصبية، ولكن أقل من الخلايا الدبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تصبح متوسطة تحتوي على DRG أو النائب غائم، الطرد المركزي تعليق على 93.9 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل المتوسطة وresuspend في المتوسطة Neurobasal (تستكمل مع 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 0.5MM L-الجلوتامين و 2٪ B-27). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد العدد الكلي للخلايا (أي الخلايا العصبية والدبقية) عن طريق عدادة الكريات. ملاحظة: عدد الخلايا اللازمة يعتمد على المعلمة القياس. لتقدير حجم الكثافة محوار، ويحتاج المرء الثقافات أكثر كثافة وبالتالي عدد أكبر من الخلايا من لقياس ثمرة neurite، حجم perikaryonalوالمتفرعة نمط من الخلايا العصبية الفردية. لقياس كثافة محوار، مثل استخدام 10،000 الخلايا (الخلايا العصبية الدبقية +) / جيد أو 1،500 الخلايا العصبية / جيد. لقياس الأشكال على الخلايا العصبية الفردية، وجيزة (1 طويلة دقيقة) trypsination من الخلايا وزرع البذور من 2،500 خلايا / جيد أو 400 الخلايا العصبية / ويوصى أيضا. العائد نموذجي من الخلايا التي تم الحصول عليها من الفئران واحدة حوالي 300،000-500،000 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور الخلايا على coverslips 13 ملم التي تم المغلفة في الليلة التي سبقت وتتصدر الآبار مع المتوسطة Neurobasal (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.5 ملي L-الجلوتامين و 2٪ B-27) (الشكل 1D). ملاحظة: استخدم بولي-D-يسين (40 ملغ / م 2) أو الأورنيثين و(1 ملغ / مل لكل منهما) المغلفة المغلفة laminin زلات الغطاء. خلايا نعلق على بولي-D-يسين سريع للغاية، وبالتالي مما يجعلها مناسبة للتجارب التي يلزم فيها العديد من الخلايا (أي قياسات كثافة محوار). التعلق Laminin الحالي هو في بعض العامةما أضعف، ولكن Laminin الحالي هو المروج قوية من ثمرة neurite. لذلك، لإجراء قياسات على الخلايا العصبية المتفرعة وطول محوار، تفضل الأورنيثين / laminin طلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا نعلق على الآبار بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وإعداد وسائل الإعلام التي استكملت استخراج (في النهائي تركيز استخراج / طاف من 100 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة البذر، وإجراء اختياري، وغسل لطيف جدا مع برنامج تلفزيوني، ثم ماصة ببطء استخراج / تستكمل طاف وسائل الإعلام (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا تنمو لمدة 48 ساعة. نضح وسائل الإعلام والإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لالمناعية (الشكل 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مزدوجة المناعي تلطيخ باستخدام الخلايا العصبية محددة (على سبيل المثال بيتا III-تويولين) والدبقية محددة (على سبيل المثال الدبقية fibriallary الحمضية بروتين / GFAP) علامات (الشكل 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس الأشكال، استخدام المجهر الضوئي مقلوب مجهزة بكاميرا CCD في تركيبة وايال البرنامج الآلي الذي يسمح مقياس كثافة محوار (انظر الجدول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس كثافة محوار من الثقافات العصبية على 4-5 photomicrographs ممثل في التكبير 200X 4 من أكثف مناطق مختلفة من النمو على كل ساترة عن طريق تتراكب 50 ميكرومتر × 50 ميكرون الشبكة وعد كثافة الألياف لكل متر مربع تقاس في ألياف المتقاطعة. ثمرة neurite، يعني عدد من الفروع في الخلايا العصبية، وطول فرع الوسط وحجم perikaryonal يمكن قياسها من اختيارها عشوائيا 30 الخلايا العصبية الانفرادي من كل ساترة عن طريق وضع علامة neurites التي وperikarya (الشكل 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة وليس الإفصاحات المالية.

ويهدف هذا البروتوكول لتوضيح المنهجية وراء البنكرياس في المختبر فحص المرونة العصبية التي تم تطويرها مؤخرا من قبل مجموعتنا لدراسة آليات المرونة العصبية في محكمة التحكيم الدائمة وCP 5. يتضمن البروتوكول إجراء لمدة ثلاثة أيام والتي يمكن بسهولة أن تطبق مرة واحد...

وقد اشتعلت تغييرات في الجهاز الهضمي (GI) التشكل العصبية وكثافة انتباه أخصائي أمراض الباطنة والأطباء لفترة طويلة، ولكن أهميتها لالفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجهاز الهضمي ما زال مجهولا 1-3. في الواقع، وترتبط العديد من الاضطرابات الشائعة GI عاليا مثل التهاب المعدة، التهاب المريء الجزر، والتهاب القولون، انسدادات، والتهاب الزائدة الدودية مع زيادة كثافة تعصيب في مناطق الأنسجة الملتهبة 1. ومع ذلك، فقد تم حتى الآن دفع أي اهتمام حقيقي لآليات ومعنى المرونة العصبية في الجهاز الهضمي. لا الأعصاب GI تغير شكليا تختلف من الأعصاب GI العادي، أي دولة طبيعية في الجهاز العصبي المعوي، من حيث وظيفتها؟ ما هي الآثار المترتبة على تغير المحتوى نيوروبيبتيدي / الناقل العصبي في الأعصاب المعوية البلاستيك؟ لا المرونة العصبية الطرفية تنطوي دائما يشير إلى تغير في الجهاز العصبي المركزي؟ وأين هي التوقعات المركزية للextri البلاستيكNSIC مسارات GI العصبية؟ ويمكن بسهولة أن تتولد سلسلة طويلة من هذه الأسئلة الأساسية عند النظر إلى قلة معرفتنا عن الجوانب الفنية للGI المرونة العصبية. دراسة GI المرونة العصبية على مستوى وظيفي يتطلب نماذج تجريبية صالحة، واستنساخه تزال تنطبق بسهولة. في عصر تزايد شعبية وقبول النماذج المعدلة وراثيا المشروطة الماوس (GECoMM)، مثل الإعدادات في الجسم الحي تحمل القدرة على توضيح جوانب لم تكن معروفة سابقا من GI المرونة العصبية بطريقة واقعية 1. ومع ذلك، فإن تصميم وإنتاج GECoMM تبقى مكلفة، وكثيفة العمالة، وخاصة، تستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإنها تتطلب بداهة اختيار الهدف المراد التضمين مشروط في الماوس المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا مثل overexpression من عامل نمو الأعصاب / نيسان الخليج في الخلايا الظهارية المعوية). وبالتالي، لقصرIGN من GECoMM ناجحة، يحتاج الباحثون بعض المؤشرات (مثل البيانات التجريبية السابقة) من هدف جدير بالاهتمام، أي أن جزيء من الفائدة (هنا NGF) يمكن على الأقل أن يتوقع أن تمارس بعض الآثار ذات الصلة بيولوجيا الأعصاب في معهد جوته. ويمكن بسهولة أن تستمد هذه المؤشرات كافية من نماذج في المختبر الذي فرعية خلية معزولة عن المكروية معقدة لفي الجسم الحي النظام يمكن cocultured انتقائي بطريقة غيروي 4-7. التشكيل الأهداف الجزيئية في مثل هذا الإعداد الثقافة غيروي هو في المتوسط ​​من الناحية الفنية أقل تعقيدا، وأسرع، وبالتالي يمكن أن تساعد في prefiltering أهداف جديرة بالاهتمام للتحقق في في الدراسات المجراة. في الآونة الأخيرة، قدمنا ​​في المختبر فحص المرونة العصبية التي صممت لمحاكاة زيادة كثافة العصبية وتضخم في شمال شرق داخل البنكرياسrves في سرطان البنكرياس الإنسان (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP) الأنسجة. هنا، تعرضت الخلايا العصبية المشتقة من الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران الجذر العقد (DRG) أو الضفيرة العضلية المعوية (MP) لمقتطفات من الأنسجة PCA مقطوعة جراحيا أو CP أنسجة العينات ومقارنة تلك المستزرعة في البنكرياس الإنسان العادي (NP) مقتطفات الأنسجة 5. بدلا من مقتطفات الأنسجة، ويمكن للمرء أيضا استخدام خط الخلية supernatants لدراسة تأثير أنواع الخلايا المحددة على المرونة العصبية. عند دمجها مع قياس كيمونسيجيا موحدة، المرونة العصبية مقايسة قدمت يسمح تقييم صالحة وقابلة للتكرار من اللدونة العصبية في البنكرياس استجابة لmicroenvironments مختلفة. خاصة، فإنه يسمح للمحاكاة 1) المرونة العصبية المورفولوجية، أي تغييرات في ثمرة neurite، المتفرعة نمط وحجم الخلايا العصبية، و2) المرونة العصبية الوظيفية، أي تغييرات في استثارة الخلايا العصبية الطرفية. علاوة على ذلك، ليس فقط الطرفية (أي </em&gt; المعوية)، ولكن أيضا المركزية (على سبيل المثال DRG أو الثانية الشوكي النظام) يمكن تضمين الخلايا العصبية في مقايسة الحاضر لتقييم رد فعل المورفولوجية والوظيفية لمختلف محتويات الأنسجة GI. في فيديو تعليمي الحاضر، ونحن لشرح بروتوكول التقنية لأداء هذا الاختبار ومناقشة مزايا ونقاط ضعفها. وعلاوة على ذلك، نود أن نلفت الانتباه إلى انطباق المفهوم الأساسي لهذا الفحص لدراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

المرونة العصبية هو سمة ملازمة للنظام والجهاز الهضمي (GI) المعوية العصبي والغدد العرقية في ظل ظروف مرضية. ومع ذلك، فإن دور المرضية في جسم المريض من المرونة العصبية في اضطرابات الجهاز الهضمي ما زال مجهولا. نماذج تجريبية الرواية التي تسمح المحاكاة والتشكيل من GI المرونة العصبية قد تمكين وتعزيز التقدير للمساهمة المرونة العصبية وبخاصة أمراض الجهاز الهضمي مثل سرطان البنكرياس (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP). هنا، نقدم بروتوكول للمحاكاة من المرونة العصبية البنكرياس في المختبر تحت ظروف استخدام الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران العقد الجذرية (DRG) والضفيرة العضلية المعوية (MP) الخلايا العصبية. هذا النهج المزدوج الخلايا العصبية يسمح ليس فقط رصد كل من المرونة العصبية، الجهاز الجوهرية وخارجي، ولكن أيضا تمثل أداة قيمة لتقييم ومورفولوجيا الخلايا العصبية الدبقية والكهربية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التشكيل وظيفية من محتويات microenvironmental الموردة لدراسة إيمباك بهمر على المرونة العصبية. بمجرد إنشائها، مقايسة المرونة العصبية الحاضر يحمل إمكانات قابلة للتطبيق على دراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.

المرونة العصبية المورفولوجية في الفئة العمرية المشار إليها من الفئران حديثي الولادة (P2-12) وكثافة البذر، والنائب DRG الخلايا العصبية بالفعل بناء الشبكات العصبية الكثيفة بعد 48 ساعة (الشكل 2A). المقارنة بين الكثافة محوا?...

Watch this Scientific Journal Video about Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay at JoVE.com

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

اللدونة العصبية هي ميزة المعترف بها على نحو متزايد، ولكن يفهم بشكل كاف من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. هنا، في المثال من اضطرابات البنكرياس الإنسان، فإننا نقدم في المختبر فحص المرونة العصبية لدراسة اللدونة العصبية في الجهاز الهضمي على مستوى كل من المورفولوجية والوظيفية.

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em&gt; في المختبر</em&gt; ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K Views.  Technische Universität München.  اللدونة العصبية هي ميزة المعترف بها على نحو متزايد، ولكن يفهم بشكل كاف من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. هنا، في المثال من اضطرابات البنكرياس الإنسان، فإننا نقدم في المختبر فحص المرونة العصبية لدراسة اللدونة العصبية في الجهاز الهضمي على م...

Video: Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

تطوير بيئة المستندة إلى الصوت الألعاب الافتراضية للمساعدة في مهارات التنقل في مكفوفين

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

A نموذج من الفئران اصابات الحبل الشوكي عنق الرحم لدراسة مرحلة ما بعد التقرحي الجهاز التنفسي المرونة العصبية

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

متعدد القطب تسجيلات صفيف من داء الصرع بعد الجراحة القشرية الأنسجة البشرية

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع<em&gt; في المختبر</em&gt; بريون تحويل البروتين الفحص

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

والمحتوى العالي<em&gt; في المختبر</em&gt; البنكرياس جزيرة β خلايا النسخ المتماثل منصة ديسكفري

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

تطبيق ملامسة نهاية إلى نهاية في بانكريتيكتومي الوسطى إليه (روبوت)

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

إينترابورتال زرع جزيرات البنكرياس في طراز الماوس

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

التصور من المجمعات Mitophagy الذاتية في الموقع في خلايا بيتا البنكرياس البشرية باستخدام القرب الربط اختبار

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...