使用磁纳米粒子转导病毒载体进行冷冻切片的原小鼠肠道器官的遗传工程

由于器官可以重述原生结构组织，以及体内肠道上皮的许多分子特征，因此该技术使我们能够在实验室中研究正常的生物学和疾病状态。该技术的主要优点是能够使用非常高效的转导方法对器官进行基因工程，具有低细胞毒性，从而允许这些基因操纵的器官的功能研究。这种技术的影响延伸到肠道疾病的治疗，因为我们可以暴露肠道器官药物和其他药物或干预措施。

此方法可用于研究其他系统中适合器官培养物的发育和病理过程，如乳房组织或在标准二维条件下生长的细胞。一般来说，在难以设计器官或其他细胞中，新进入这种方法的个体将成功地进行转导。当我们在转移植器官和干细胞时遇到困难时，我们首先想到了这种方法。

这种方法的视觉演示至关重要，因为如果在嵌入过程中样品未得到适当处理，则可能会发生器官结构损失，以进行低温分段。为了培育用于病毒转导的器官，种子器官细胞培养物，每井在48井板中培养200微升转导介质，并在标准组织培养孵化器中孵育。解冻用于转导的病毒小瓶，允许约50微升的浓缩病毒，用于转导48孔板中每口井。

在1.5毫升管中，将病毒与12微升的磁性纳米粒子溶液混合，在室温下孵育15分钟。15分钟后，将磁性纳米粒子溶液和病毒混合物加入要转导的细胞中。将48井板放在磁板上，并在标准组织培养培养箱中孵育至少两个小时。

当病毒转染完成时，将受感染的器官细胞簇和转导培养素从每个井转移到1.5毫升管中。在500次g下离心5分钟。用温和的吸力丢弃上清液，冷却冰上含有颗粒的管子五分钟。

在每个管中加入120微升的基底膜基质，然后缓慢上下移液，重新暂停颗粒。种子30微升滴基质细胞混合物到一个新的48井板。在37摄氏度下孵育板5至15分钟，直到基质凝固。

在每个井中加入转导介质，并在标准组织培养培养箱中孵育三到四天。三到四天后，在10倍放大的光显微镜下检查培养物，以确保细胞簇组织成器官结构。用250微升的有机培养ENR介质轻轻更换每井中的转导介质。

将盘子返回孵化器。通过轻轻吸气去除 ENR 介质开始此过程，小心不要扰动地下室膜基质。用 500 微升 PBS 轻轻清洗。

通过每井添加一个4%的甲醛溶液的微升，并在室温下孵育30分钟，修复器官。30分钟后，通过吸气去除甲醛溶液。轻轻添加每口一微升的 PBS，然后轻轻吸气去除 PBS。

以这种方式，用 PBS 洗两次。从第二次洗涤中去除 PBS，并在每个样品中加入一个 30% 蔗糖缓冲液的微升。在四摄氏度下在蔗糖中孵育固定有机物一小时，使样品脱水。

通过吸气去除蔗糖缓冲液，并添加足够的嵌入化合物，以覆盖每个井中的基质层。在室温下孵育五分钟。接下来，将样品放在零下80摄氏度的冰柜中10分钟，或直到嵌入化合物变成固体和白色。

将板与冷冻嵌入化合物在室温下放置，以便沿边缘将化合物熔化最小。使用手术刀或铲子将方块与井壁分开。快速工作以防止熔化，使用钳子去除基体嵌入复合块，并将其放在试样块中。

用嵌入化合物完全填充模具。在零下 80 摄氏度下冻结 30 分钟，然后使用块进行剖分。该协议通过首先通过与GP相关的扁病毒载体的肠道器官进行转化进行了优化。

GFP在器官发育的每个阶段都被可视化，包括早期当低温细胞组织成囊肿状结构时，或在后来的阶段，当器官形成芽。成功转导的肠道器官随后被正式固定，冷冻，并通过免疫荧光成像进行分析。在此图像中，核被染成蓝色，绿色表示上皮细胞粘附分子，从而划定细胞边界。

红色表示利索索姆染色，以识别窗格细胞。一旦掌握，转染器官可以在大约三个小时内完成，器官的哭声嵌入可以在大约2个半小时内完成。尝试此过程时，在处理基底基质试剂时，必须记住在冰上工作。

完成此过程后，可以进行免疫荧光分析和其他检测蛋白质或细胞器的方法，以评估定位或相对丰度。这项技术为研究人员探索体外的正常生物学和疾病状态铺平了道路，也为体内研究（如果转导的器官或细胞可以植入小鼠）铺平了道路。看完这段视频后，你应该对如何使用磁性标记的病毒进行基因工程，进行冷冻的器官。

请不要忘记，使用病毒可能极其危险，执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的防护装备。