Da Organoide die einheimische Strukturorganisation sowie viele molekulare Merkmale des Darmepithels in vivo rekapitulieren, ermöglicht uns diese Technik, normale Biologie und Krankheitszustände im Labor zu studieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Organoide mit einem sehr hocheffizienten Transduktionsansatz mit geringer Zytotoxizität zu gentechnisch zu entwickeln und somit funktionelle Studien dieser genetisch manipulierten Organoide zu ermöglichen. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie bei Darmerkrankungen, weil wir Darmorganoide Drogen und anderen Wirkstoffen oder Interventionen aussetzen können.
Diese Methode kann angewendet werden, um Entwicklungs- und pathologische Prozesse in anderen Systemen zu untersuchen, die organoiden Kulturen zugänglich sind, wie Brustgewebe oder für Zellen, die unter Standard-2D-Bedingungen wachsen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu bei dieser Methode sind, mit der Transduktion in schwer zu entwickelnden Organoiden oder anderen Zellen erfolgreich sein. Die Idee zu dieser Methode hatten wir zum ersten Mal, als wir Schwierigkeiten bei der Transducing unserer Organoide und Stammzellen hatten.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da ein struktureller Verlust der Organoide auftreten kann, wenn Proben während des Einbettungsprozesses nicht ordnungsgemäß in die Kellermatrix für kryosectioning behandelt werden. Um Organoide für virale Transduktion zu züchten, Samen organoiden Zellkulturen mit 200 Mikroliter Transduktionsmedium pro Brunnen in einer 48-Well-Platte, und inkubieren in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator. Taudurchstiche von Virus zur Transduktion, so dass für etwa 50 Mikroliter konzentrierten Virus für die Transduktion jedes Brunnens in 48-Well-Platten.
Mischen Sie das Virus in einer 1,5-Milliliter-Röhre mit 12 Mikrolitern einer magnetischen Nanopartikellösung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten lang. Nach 15 Minuten die magnetische Nanopartikellösung und das Virusgemisch zu den zu transduzierenden Zellen hinzufügen. Legen Sie die 48-Well-Platte auf eine Magnetplatte und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator.
Wenn die virale Transfektion abgeschlossen ist, übertragen Sie die infizierten organoiden Zellhaufen und transduktionsmittel von jedem Brunnen in eine 1,5-Milliliter-Röhre. Zentrifuge bei 500 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand mit sanfter Absaugung und kühlen Sie die Rohre, die das Pellet enthalten, fünf Minuten lang auf Eis.
Fügen Sie 120 Mikroliter Kellermembranmatrix zu jedem Rohr hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen. Säen Sie 30-Mikroliter-Tropfen der Matrix-Zell-Mischung in eine neue 48-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf bis 15 Minuten, bis die Matrix erstarrt.
Fügen Sie transduktionsmittel zu jedem Brunnen hinzu und in kubieren Sie in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator für drei bis vier Tage. Nach drei bis vier Tagen die Kulturen unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung zu inspizieren, um die Organisation von Zellclustern in organoiden Strukturen zu gewährleisten. Ersetzen Sie das Transduktionsmedium in jedem Brunnen sanft durch 250 Mikroliter Organoidkultur ENR Medium.
Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das ENR-Medium durch sanftes Absaugen entfernen, wobei Sie darauf achten, die Kellermembranmatrix nicht zu stören. Mit 500 Mikroliter PBS vorsichtig waschen.
Fixieren Sie die Organoide, indem Sie einen Mikroliter 4%Paraformaldehydlösung pro Brunnen hinzufügen, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach 30 Minuten die Paraformaldehydlösung durch Absaugen entfernen. Fügen Sie vorsichtig einen Mikroliter PBS pro Brunnen hinzu, und entfernen Sie dann das PBS durch sanftes Absaugen.
Auf diese Weise zweimal mit PBS waschen. Entfernen Sie die PBS aus der zweiten Wäsche, und fügen Sie jeder Probe einen Mikroliter 30% Saccharosepuffer hinzu. Inkubieren Sie die festen Organoide in Saccharose für eine Stunde bei vier Grad Celsius, um die Proben zu dehydrieren.
Entfernen Sie den Saccharosepuffer durch Absaugen, und fügen Sie gerade genug Einbettungsmasse hinzu, um die Matrixschicht in jedem Brunnen zu bedecken. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Als nächstes legen Sie die Proben in einem minus 80-Grad-Gefrierschrank für 10 Minuten oder bis die Einbettungsmasse fest und weiß wird.
Platzieren Sie die Platte mit gefrorener Einbettungsmasse bei Raumtemperatur, um ein minimales Schmelzen der Verbindung entlang der Kanten zu ermöglichen. Verwenden Sie ein Skalpell oder Spachtel, um den Block von den Wänden des Brunnens zu trennen. Arbeiten Sie schnell, um das Schmelzen zu verhindern, indem Sie Zangen verwenden, um den Matrix-Einbettungs-Verbindungsblock zu entfernen, und ihn in einen Probenblock legen.
Füllen Sie die Form vollständig mit Einbettungsmasse. Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius für 30 Minuten, bevor Sie den Block für die Schnitte verwenden. Dieses Protokoll wurde durch die erste Transdution von Darmorganoiden mit lentiviralen Vektoren, die mit GFP verbunden sind, optimiert.
Das GFP wurde in jedem Stadium der organoiden Entwicklung visualisiert, auch früh, wenn sich Kryptazellen in zystische Strukturen organisieren oder zu späteren Zeitpunkten, wenn Organoide Knospen bilden. Erfolgreich transduzierte Darmorganoide wurden dann formalinfixiert, kryosectioniert und mittels Immunfluoreszenzbildgebung analysiert. In diesem Bild sind Kerne blau gefärbt, und das Grün zeigt Epithelzelladhäsionsmoleküle an, die Zellränder abgrenzen.
Das Rot zeigt Lysosome-Färbung an, um Paneth-Zellen zu identifizieren. Einmal gemeistert, können transduzessierende Organoide in etwa drei Stunden durchgeführt werden, und Organoide Krysektion Einbettung kann in etwa 2 1/2 Stunden durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, beim Umgang mit Kellermatrix-Reagenzien auf Eis zu arbeiten.
Nach Abschluss dieses Verfahrens können immunfluoreszierende Analysen und andere Methoden zum Nachweis von Proteinen oder Organellen durchgeführt werden, um die Lokalisation oder den relativen Überfluss zu bewerten. Diese Technik ebnet den Forschern die Möglichkeit, normale Biologie und Krankheitszustände in vitro zu erforschen und auch für In-vivo-Studien, wenn die transduzierten Organoide oder Zellen in Mäuse implantiert werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie sie magnetisch markierte Viren verwenden können, um Organoide für die Kryosektion zu entwickeln.
Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Viren extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Schutzausrüstung sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.
