Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о возмущениях в сигнальных сетях, которые могут вызвать рост рака или развитие устойчивости к конкретным методам лечения. Основным преимуществом этого метода является то, что он может обеспечить быструю и надежную обратную связь о состоянии фосфорилирования нескольких сетей, которые часто дерегулированы при раке. Смысл этого метода распространяется на терапию лекарственно-устойчивых раковых заболеваний, поскольку выявление изменений и пост-трансляционных изменений может прояснить изменения в активности пути трансдукции сигнала.
Хотя этот метод используется при фосфорилации, он также может быть использован для взгляда на другие пост-трансляционные изменения, такие как гликозилирование и повсеместное распространение. Начните с тщательного полоскания ночь культурных клеток в три раза с 10 миллилитров PBS заботиться, чтобы удалить все PBS после последней стирки. Далее добавьте соответствующий объем буфера лиза из набора анализа белка и используйте клеточный скребок, чтобы отделить клетки.
Тритурировать полученный раствор клетки примерно 10 раз, прежде чем перевести по крайней мере один раз 10 в седьмую клетку в 1,5 миллилитровую трубку. Инкубировать клетки в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию со тряской. Затем загрузите лисат в шприц, оснащенный иглой 27 калибра и аспиратом, и раздайте образец 10 раз, чтобы спарить клеточные мембраны.
Когда клеточные мембраны были полностью нарушены, центрифуга лизировать и передать супернатант в новую 1,5 миллилитровую трубку для последующей общей количественной оценки белка в соответствии со стандартными протоколами. Для выполнения анализа фосфокиназы человека, сначала используйте пинцет с плоским наконечником, чтобы поместить одну мембрану массива в каждый колодец из четырех хорошо мульти-трей, содержащий два миллилитров свежеприготовленного буфера массива по одному на колодец с числом мембран, обращенных вверх. После погружения краситель на мембране исчезнет.
Накройте лоток крышкой и инкубировать мембраны на качалке платформы в течение 60 минут при комнатной температуре. Во время этой блокирующей инкубации разбавляют каждый образец лизата до 50-100 микрограммов концентрации белка в максимальном объеме 334 микролитров буфера лиза и доводят конечный объем извлеченного образца белка до 1,5 миллилитров со свежим буфером массива. Далее, тщательно аспирировать массив буфера из каждой колодец мульти-tray и инкубировать мембраны с 1,5 миллилитров образца белка на колодец ночь на два-восемь градусов по Цельсию на качалке платформы шейкер.
На следующее утро тщательно перенесите каждый массив в отдельные пластиковые контейнеры, содержащие 20 миллилитров буфера для мытья в течение трех 10 минут моет на качалке платформы при комнатной температуре. После последней стирки добавьте 20 микролитров соответствующего восстановленного коктейля антител в два миллилитров буфера массива, два на колодец, и тщательно промокните нижний край каждой мембраны на бумажном полотенце, чтобы удалить лишний буфер стирки. Затем поместите каждый массив обратно в соответствующий колодец лотка антитела и накройте лоток для двухчасовой инкубации при комнатной температуре на качалке платформы.
В конце инкубации, тщательно перенесите каждый массив в новый пластиковый контейнер 8 на 11 сантиметров, содержащий 20 миллилитров буфера стирки в течение трех 10-минутных мойок, как только что продемонстрировано. После последней стирки добавьте один миллилитр соответствующего раствора стрептавидина хрена пероксидаса в каждую скважину многоядерного лотка и верните мембраны в соответствующие скважины для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации поместите каждую мембрану между двумя кусками пятимиллиметровой фильтровальной бумаги, чтобы удалить излишки буфера и инкубировать высушенные мембраны соответствующим раствором обнаружения пероксидазы хрена в течение трех минут.
Затем поместите мембраны в отдельные четкие пластиковые протекторы листа для последующей визуализации. Чтобы оценить экспрессию рецептора тирозинкиназы в каждом образце, откройте изображения в соответствующей программе обработки изображений, такой как Image J, и выберите Edit и Invert из соответствующих меню высадки, чтобы инвертировать черные пятна на белом фоне изображения в белые пятна на черном фоне. Далее используйте овальный инструмент, чтобы окружить одну пару белых точек на пятно точки и выбрать анализ и меру, чтобы автоматически открыть новое окно, отображая значения для выбранной области.
Затем поместите точку стрелки мыши в центр овала и перетащите круговую область вокруг следующей области точки, пока не будут измерены все точки интереса. В этом репрезентативном эксперименте, влияние тирозин киназы ингибитор устойчивость на пути трансдукции сигнала был проанализирован в одном контроле в трех тирозин киназы ингибитор устойчивых клеточных линий. Было выбрано шесть фосфо белков с дифференциальной активностью, и относительная интенсивность была определена для нескольких белков-кандидатов в каждой клеточной линии.
Как показала тепловая карта, после этого может быть получена полуколичебринная считывание изменений фосфорилирования белками белка важных сигнальных белков. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы начать со здоровыми и активно деления клеток, как стрессоры могут вызвать изменения в активности пути трансдукции сигнала. После этой процедуры, другие методы, такие как цифровой ПЦР и иммуноблоттинга могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как изменения в фосфорилации привести к активации транскрипционных факторов?
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в биологии рака, чтобы исследовать фундаментальные изменения в пост-трансляционной модификации белков, ведущих к появлению персонализированной медицины для пациентов с раком. Не забывайте, что работа с линиями раковых клеток является чрезвычайно опасным, поэтому не забудьте использовать асептические методы, осторожность при утилизации острых и носить лабораторное пальто во все времена.
