이 방법은 암 성장을 유발하거나 특정 치료에 대한 저항의 발달을 일으킬 수있는 신호 네트워크의 혼란에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 암에서 자주 규제되는 여러 네트워크의 인산화 상태에 신속하고 신뢰할 수있는 피드백을 제공 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 변경 및 번역 후 수정의 식별신호 변환 통로 활동에 있는 변경을 해명할 수 있기 때문에 약 저항하는 암의 치료로 확장합니다.
이 기술은 인산화에 사용되지만, 글리코실화 및 유비쿼터틸화와 같은 다른 번역 후 수정을 보는 데사용할 수도 있습니다. 마지막 세척 후 PBS를 모두 제거하기 위해 주의하는 PBS의 10 밀리리터로 야간 배양 세포를 세 번 완전히 헹구는 것으로 시작합니다. 다음으로, 단백질 분석 키트로부터 적절한 양의 용해 완충제를 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리한다.
결과 세포 용액을 약 10회 트리투레이한 후 1.5 밀리리터 튜브로 7세포로 10회 이상 이송한다. 셀을 섭씨 4도에서 30분간 배양하여 흔들어 보임합니다. 그런 다음 27 게이지 바늘이 장착된 주사기에 용액을 적재하고 샘플을 10번 분배하여 세포막을 전단합니다.
세포막이 완전히 중단되었을 때, 원심분리기 는 용해를 원심분리하고 표준 프로토콜에 따라 후속 총 단백질 정량화를 위해 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 전달합니다. 인간 인포키나아제 분석기를 수행하려면 먼저 평평한 핀셋을 사용하여 4웰다트 트레이의 각 웰에 1개의 어레이 멤브레인을 배치하여 막의 수와 잘 함께 새로 준비된 어레이 버퍼 1개씩 들어 놓습니다. 침수시 멤브레인의 염료가 사라집니다.
트레이를 뚜껑으로 덮고 실온에서 60분 동안 흔들 플랫폼 셰이커의 멤브레인을 배양합니다. 이 차단 인큐베이션 동안, 각 용액 샘플을 최대 334 마이크로리터의 최대 부피로 50-100 마이크로그램의 단백질 농도로 희석하고 신선한 어레이 버퍼로 추출된 단백질 샘플의 최종 부피를 최대 1.5 밀리리터까지 가져옵니다. 다음으로, 멀티 트레이의 각 우물에서 배열 버퍼를 조심스럽게 흡인하고 흔들 플랫폼 셰이커에서 섭씨 2~8도에서 하룻밤 동안 1.5 밀리리터의 단백질 샘플로 멤브레인을 배양합니다.
다음 날 아침, 각 배열을 각 배열을 실온에서 흔들리는 플랫폼에서 10분 동안 세척 버퍼 20밀리리터가 들어 있는 개별 플라스틱 용기에 조심스럽게 옮겨 넣습니다. 마지막 세척 후, 적절한 재구성 된 항체 칵테일 20 마이크로 리터를 배열 버퍼 2 개, 우물 당 2 개에 추가하고 종이 타월에 각 멤브레인의 하부 가장자리를 조심스럽게 얼룩서 과도한 세척 버퍼를 제거하십시오. 그런 다음 각 어레이를 항체 트레이의 적절한 우물에 다시 넣고 흔들 플랫폼의 실온에서 2 시간 인큐베이션을 위해 트레이를 덮습니다.
인큐베이션이 끝나면 각 어레이를 11센티미터 의 새로운 8x 11센티미터 플라스틱 용기에 조심스럽게 옮기고 20밀리리터의 워시 버퍼를 함유하여 방금 입증된 대로 3개의 10분 세척을 위해 세척할 수 있습니다. 마지막 세척 후, 멀티 웰 트레이의 각 우물에 적절한 스트렙타비딘 말 무 과록시다제 용액의 1 밀리리터를 추가하고 실온에서 30 분 잠복에 대한 적절한 우물에 멤브레인을 반환합니다. 인큐베이션의 끝에, 여분의 버퍼를 제거하고 3 분 동안 적절한 말 무 과산화제 검출 솔루션으로 건조 된 멤브레인을 인큐베이션 5 밀리미터 필터 종이의 두 조각 사이에 각 멤브레인을 배치합니다.
그런 다음 멤브레인을 개별 투명 플라스틱 시트 보호대에 배치하여 후속 이미징을 합니다. 각 샘플에서 수용체 티로신 키나아제 발현을 평가하기 위해 이미지 J와 같은 적절한 이미지 처리 프로그램에서 이미지를 열고 적절한 드롭다운 메뉴에서 편집 및 반전을 선택하여 이미지의 흰색 배경의 검은 반점을 검은 색 배경의 흰색 반점으로 반전시다. 다음으로 타원형 도구를 사용하여 도트 블롯에 흰색 점 한 쌍을 둘러싸고 분석 및 측정을 선택하여 선택한 영역에 대한 값을 표시하는 새 창을 자동으로 엽니다.
그런 다음 마우스 화살표의 점을 타원형의 중앙에 놓고 관심있는 모든 반점이 측정 될 때까지 다음 점 영역 주위의 원형 영역을 드래그합니다. 본 대표적인 실험에서, 신호 전도 경로에 대한 티로신 키나제 억제제 저항성의 효과는 3개의 티로신 키나아제 억제제 내성 세포주에서 하나의 대조군으로 분석되었다. 차동 활성을 가진 6개의 인광 단백질을 선택하였고 상대적 강도는 각 세포주에서 여러 후보 단백질에 대해 결정되었다.
히트 맵에 의해 입증된 바와 같이, 중요한 신호 트랜스듀션 단백질의 단백질 인산화의 변화에 대한 반정량적 판독이 생성될 수 있었다. 이 절차를 시도하는 동안, 스트레스가 신호 변환 경로 활동에 변화를 유도 할 수 있으므로 건강하고 적극적으로 세포를 분할하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 디지털 PCR 및 면역 블로팅과 같은 다른 방법은 인산화의 변화가 전사 요인의 활성화로 이어지는 것과 같은 추가 질문에 대답하는 데 사용될 수 있습니까?
개발 후, 이 기술은 암 생물학에 있는 연구원이 암을 가진 환자를 위한 개인화한 약의 출현으로 이끌어 내는 단백질의 번역 후 수정에 있는 근본적인 변경을 탐구하는 도로를 포장했습니다. 암 세포주로 일하는 것은 매우 위험하므로 날카로운 것을 처분하고 항상 실험실 코트를 착용 할 때 무균 기술을 사용하고주의하십시오.
