Bu yöntem, kanser büyümesine veya belirli tedavilere karşı direnç gelişimine neden olabilecek sinyal ağlarındaki tedirginliklerle ilgili anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kanserde sıklıkla deregüle olan birden fazla anın fosforilasyon durumu hakkında hızlı ve güvenilir geri bildirim sağlayabilmektir. Bu tekniğin anlamı, değişikliklerin ve çeviri sonrası değişikliklerin tanımlanması sinyal transdüksiyon yolu aktivitesindeki değişiklikleri açıklığa kavuşturabileceğinden, ilaca dirençli kanserlerin tedavisine kadar uzanır.
Bu teknik fosforilasyonda kullanılırken, glikozilasyon ve ubiquitylation gibi diğer çeviri sonrası modifikasyonlara bakmak için de kullanılabilir. Son yıkamadan sonra tüm PBS kaldırmak için özen pbs 10 mililitre ile gecede kültürlü hücreleri üç kez iyice durulama ile başlayın. Daha sonra, protein tsay kitinden uygun lysis tampon hacmini ekleyin ve hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Ortaya çıkan hücre çözeltisini, en az bir kez 10 kez yedinci hücrelere 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce yaklaşık 10 kez triturate. Hücreleri sallayarak 4 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra lysate'yi 27 kalibrelik bir iğneile donatılmış bir şırıngaya yükleyin ve hücre zarlarını kesmesi için numuneyi 10 kez aspire edin.
Hücre zarları tamamen bozulduğunda, lysat santrifüj ve standart protokollere göre sonraki toplam protein niceliği için yeni bir 1.5 mililitrelik tüp supernatant transfer. Bir insan fosfokizaz tsay gerçekleştirmek için, ilk dört iyi çok tepsi her kuyu içine bir dizi membran yerleştirmek için düz uçlu cımbız kullanmak taze hazırlanmış dizi tampon iki mililitre içeren bir iyi membranların sayıları kadar bakan. Daldırma üzerine, membran üzerindeki boya kaybolur.
Tepsiyi bir kapakla kapatın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sallanan bir platform çalkalayıcı üzerinde membranları kuluçkaya yatırın. Bu engelleme kuluçka sırasında, her lysate numunesini maksimum 334 mikrolitre likit tampon hacminde 50 ila 100 mikrogram protein konsantrasyonuna seyreltin ve çıkarılan protein numunesinin son hacmini taze dizi tamponuyla 1,5 mililitreye kadar getirin. Daha sonra, çok tepsili her kuyudan dizi tamponu dikkatlice aspire ve bir sallanan platform shaker üzerinde iki ila sekiz santigrat derece de iyi bir gecede protein örneği 1,5 mililitre ile membranlar inkübe.
Ertesi sabah, oda sıcaklığında sallanan bir platformda üç 10 dakikalık yıkama için 20 mililitre yıkama tamponiçeren tek tek plastik kaplara her diziyi dikkatlice aktarın. Son yıkamadan sonra, dizi tampon iki mililitre uygun yeniden antikor kokteyl 20 mikrolitre ekleyin, iyi başına iki, ve dikkatle herhangi bir aşırı yıkama tampon kaldırmak için bir kağıt havlu üzerinde her membranın alt kenarı leke. Daha sonra her diziyi antikor tepsisinin uygun kuyularına geri yerleştirin ve sallanan bir platformda oda sıcaklığında iki saatlik bir kuluçka için tepsiyi kapatın.
Kuluçka sonunda, her diziyi, az önce gösterildiği gibi, 20 mililitre yıkama tamponu içeren 11 santimetrelik plastik bir kapta her diziyi dikkatlice yeni bir sekize aktarın. Son yıkamadan sonra, çok kuyulu tepsinin her kuyuya uygun bir streptavidin at turp peroksidaz çözeltisi bir mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için membranları uygun kuyulara geri döndürün. Kuluçka sonunda, herhangi bir aşırı tampon kaldırmak ve üç dakika için uygun bir at turp peroksidaz algılama solüsyonu ile kurutulmuş membranlar inkübün beş milimetre filtre kağıt iki adet arasında her membran yerleştirin.
Daha sonra sonraki görüntüleme için bireysel açık plastik levha koruyucuları içine membranlar yerleştirin. Her örnekteki reseptör tirozin kinaz ekspresyonunu değerlendirmek için, görüntüleri Image J gibi uygun bir görüntü işleme programında açın ve resmin beyaz arka planındaki siyah noktaları siyah arka plandaki beyaz noktalara ters düşürmek için uygun açılır menülerden Edit ve Ters Çevir'i seçin. Ardından, nokta lekesindeki bir çift beyaz noktayı çevrelemek için Oval aracı kullanın ve seçili alanın değerlerini gösteren yeni bir pencereyi otomatik olarak açmak için Çözümle ve Ölçü'ü seçin.
Daha sonra fare okunun noktasını ovalin ortasına yerleştirin ve tüm ilgi noktaları ölçülene kadar bir sonraki nokta alanının etrafındaki dairesel alanı sürükleyin. Bu temsili deneyde tirozin kinaz inhibitör direncinin sinyal transdüksiyon yolları üzerindeki etkileri üç tirozin kinaz inhibitörü dirençli hücre hattında tek bir kontrolde analiz edilmiştir. Diferansiyel aktiviteye sahip altı fosfo proteini seçilmiş ve her hücre hattındaki çeşitli aday proteinler için göreceli yoğunluk saptakiftir.
Isı haritasında da gösterildiği gibi, önemli sinyal transdüksiyon proteinlerinin protein fosforilasyonundaki değişiklikler üzerine yarı nicel bir okuma oluşturulabilir. Bu yordamı çalışırken, stresörler sinyal transdüksiyon yolu aktivitesinde değişikliklere neden olabilir gibi sağlıklı ve aktif olarak bölen hücreleri ile başlamak için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, dijital PCR ve immünoblotting gibi diğer yöntemler, transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuna yol açan fosforilasyon değişiklikleri gibi ek soruları cevaplamak için kullanılabilir?
Gelişiminden sonra, bu teknik kanser hastaları için kişiselleştirilmiş tıbbın gelişine yol açan proteinlerin post-çevirideğişiklik temel değişiklikleri keşfetmek için kanser biyolojisi araştırmacılar için yol açmıştır. Kanser hücre hatları ile çalışan son derece tehlikeli olduğunu unutmayın bu yüzden aseptik teknikleri kullandığınızdan emin olun, keskin atma ve her zaman bir laboratuvar önlüğü giymek dikkatli.
