この方法は、がんの成長や特定の治療法に対する耐性の発達を引き起こす可能性のあるシグナル伝達ネットワークの摂動に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、癌で頻繁に規制緩和される複数のネットワークのリン酸化状態に関する迅速かつ信頼性の高いフィードバックを提供できることである。この技術の意味は、変化と翻訳後の改変の同定がシグナル伝達経路活性の変化を解明することができるので、薬剤耐性癌の治療にまで及ぶ。
この技術はリン酸化に使用されますが、グリコシル化やユビキタス化などの他の翻訳後修飾を調べることもできます。最後の洗浄後にPBSのすべてを除去するように注意してPBSの10ミリリットルで一晩培養細胞を3回徹底的にすすぐから始めます。次に、タンパク質アッセイキットから適切な量のリシスバッファーを追加し、細胞スクレーパーを使用して細胞を取り外します。
得られた細胞溶液を約10回トリチュレートしてから、少なくとも10回、7番目の細胞に1.5ミリリットルのチューブに移す。細胞を摂氏4度で30分間振るとインキュベートします。その後、27ゲージ針を装着したシリンジにライセートをロードし、サンプルを10回分配して細胞膜を剪断します。
細胞膜が完全に破壊されたら、遠心分離して、その上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、その後の全タンパク質定量を標準プロトコルに従って定量します。ヒトホスホキナーゼアッセイを実行するには、まず平らな先端のピンセットを使用して、2ミリリットルの新しく調製されたアレイバッファーを含む4ウェルマルチトレイの各ウェルに1つのアレイ膜を配置し、膜の数を上に向けます。水中に沈むと、膜上の染料が消えます。
蓋でトレイを覆い、ロッキングプラットフォームシェーカーの膜を室温で60分間インキュベートします。このブロッキングインキュベーションの間に、各ライセートサンプルを最大334マイクロリットルのリシスバッファーの最大体積で50〜100マイクログラムのタンパク質濃度に希釈し、抽出されたタンパク質サンプルの最終量を新鮮なアレイバッファーで最大1.5ミリリットルにします。次に、マルチトレイの各ウェルからアレイバッファーを慎重に吸引し、ロッキングプラットフォームシェーカーで摂氏2〜8度で一晩あたり1.5ミリリットルのタンパク質サンプルで膜をインキュベートします。
翌朝、各アレイを20ミリリットルの洗浄バッファーを含む個々のプラスチック容器に慎重に移し、室温でロッキングプラットフォームで10分間の洗浄を3回行います。最後の洗浄後、適切な再構成された抗体カクテルの20マイクロリットルをアレイバッファーの2ミリリットル(ウェルあたり2つ)に加え、ペーパータオルで各膜の下端を慎重にブロットして余分な洗浄バッファーを取り除きます。次に、各アレイを抗体のトレイの適切なウェルに戻し、ロッキングプラットフォーム上の室温で2時間のインキュベーションのためにトレイを覆います。
インキュベーションの最後に、示したように、20ミリリットルの洗浄バッファーを含む新しい8%11センチメートルのプラスチック容器に各アレイを慎重に移します。最後の洗浄の後、マルチウェルトレイの各ウェルに適切なストレプトアビジン馬根ペルオキシダーゼ溶液を1ミリリットル加え、膜を適切なウェルに戻し、室温で30分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、5ミリメートルのろ紙の2つの部分の間に各膜を置き、余分な緩衝液を取り除き、乾燥した膜に適切な馬根ペルオキシダーゼ検出溶液を3分間インキュベートします。
その後、その後のイメージングのために個々の透明なプラスチックシートプロテクターに膜を配置します。各サンプルの受容体チロシンキナーゼの発現を評価するには、画像Jなどの適切な画像処理プログラムで画像を開き、適切なドロップダウンメニューから[編集]と[反転]を選択して、画像の白い背景の黒い斑点を黒い背景の白い斑点に反転させます。次に、楕円ツールを使用して、1 組の白い点をドット ブロットに囲み、[解析と測定] を選択して、選択した領域の値を表示する新しいウィンドウを自動的に開きます。
次に、マウスの矢印の点を楕円の中心に配置し、対象となるすべてのスポットが測定されるまで、次のドット領域の周りに円形の領域をドラッグします。本代表的実験では、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がシグナル伝達経路に及ぼす影響を、3つのチロシンキナーゼ阻害剤耐性細胞株中の1つのコントロールで分析した。微分活性を有する6つのホスホタンパク質を選択し、各細胞株内のいくつかの候補タンパク質について相対的な強度を決定した。
ヒートマップで示されるように、重要なシグナル伝達タンパク質のタンパク質リン酸化の変化に関する半定量的読み出しが生成される可能性があります。この手順を試みる間, ストレス筋がシグナル伝達経路活性の変化を誘発する可能性があるため、健康で積極的に細胞を分割して開始することを覚えておくことが重要です。.この手順に従って、デジタルPCRやイムノブロット法などの他の方法を使用して、リン酸化の変化が転写因子の活性化につながるなどの追加の質問に答えることができますか?
その開発後、この技術は、がん生物学の研究者が、がん患者のための個別化医療の出現につながるタンパク質の翻訳後修飾の根本的な変化を探求する道を開いた。がん細胞株での作業は非常に危険なので、無菌技術を使用し、シャープを処分する際には注意し、常にラボコートを着用してください。
