该协议引入了一种定义的支线细胞自由方法，用于将角膜边缘上皮干细胞与人类多能干细胞进行区分。肢上皮干细胞负责在健康的眼睛中更新角膜上皮。这些细胞的损伤导致一种称为边缘干细胞缺乏症的情况，并导致角膜清晰度的丧失。
此处所示的细胞培养方法能够有效生产肢体上皮干细胞，用于未来的角膜细胞替代疗法。首先，通过和维护文本协议中概述的免费人类多能干细胞培养。确保只使用高质量的人类多能干细胞作为分化的起始材料。
当准备诱导胚胎体形成时，将所需的所有材料和试剂加热到层流罩中的室温。通过向每口井添加 500 微升的异种自由蛋白蛋白 EDTA，将喂食器自由人多能干细胞分离到悬浮液中。在37摄氏度下孵育，二氧化碳为5%。
三分钟后，从培养箱中取出细胞，检查细胞形态，以确定去除三辛的最佳阶段。仔细观察细胞，以确定最佳时间去除异种自由尝试EDTA，当细胞已经四舍五入，但还没有完全分离。在最佳时间，从细胞中去除无异种的尝试素EDTA。
添加定义的三辛抑制剂和轻轻移液器分离细胞。在50毫升离心管中收集单细胞悬浮液。在300g下离心5分钟。
然后，去除上心，并在培养培养的一毫升中重新暂停细胞。数数细胞后，将两到三百万个细胞在三毫升基底诱导介质中分配，并辅以五微摩尔血红素，以低附六井板的每个井。在37摄氏度下孵育，二氧化碳为5%。
第二天，在显微镜下检查胚胎体的质量。去除介质，代之以三毫升基底感应介质，辅以10微摩尔SB-505124和50毫微克每毫升人类基本玻璃纤维生长因子。继续在37摄氏度下孵育，二氧化碳为5%。
之后两天，取出该介质，代之以三毫升的基础诱导介质，每毫升骨形态遗传蛋白四分之二五纳米。然后，使用以前的条件继续孵育。在第四天，准备每平方厘米的拉米宁-5210.5微克的混合物，以及每平方厘米5微克的人类胎盘胶原蛋白四型，在含有钙2和镁2离子的DPBS中稀释。
使用这种混合物，涂覆100毫米组织培养皿，使粘附剂分化，总涂层体积为每盘5毫升。密封盘子，并储存在四摄氏度过夜。在第五天，将所有所需的材料和试剂加热到层流罩中的室温。
在此之后，去除涂层溶液，并添加 10 毫升预热分化介质到每个菜。使用移液器，将胚胎体从一个盘子中移植到两到三个组织培养皿中。然后，轻轻摇动每个培养皿，均匀分布胚胎体。
在未来两个半星期到三周内，在37摄氏度的粘附培养下保持细胞的二氧化碳，确保每周三次用10毫升新鲜分化介质代替该培养。使用相位对比显微镜定期检查细胞是否出现正确的上皮形态。首先，将所需的所有材料和试剂预热至层流罩中的室温，但应预冷冻的低温保存介质除外。
接下来，通过加入无异种的三辛蛋白EDTA，在37摄氏度下以5%的二氧化碳孵育，将人类多能干细胞衍生的肢体上皮干细胞分离到单细胞悬浮液中。五分钟后，从培养箱中取出细胞并检查细胞形态，以确定去除三辛的最佳阶段。仔细观察细胞，以确定最佳时间，以删除异种自由尝试素EDTA，当细胞已经四舍五入，但尚未完全分离。
在最佳时间，从细胞中去除异种自由尝试素 EDTA，并如前所述分离细胞。数数细胞后，以300g离心5分钟。吸气介质，并在预冷的异种自由冷冻保存介质中重新释放细胞。
使用移液器，将单细胞悬浮液转移到低温管中，使每个冷冻管在一毫升低温保存介质中含有50万到100万个细胞。将管子放在冷冻容器中。在五分钟内，将它们转移到一个冷冻室在负80摄氏度过夜存储。
第二天，将管子转移到液氮中长期储存。在解冻细胞之前，用每平方厘米五微克的人类胎盘胶原蛋白四型和每平方厘米 LM-521 的 0.5 微克的混合物，将所有所需的材料和试剂预热，使其达到层流罩中的室温。接下来，从盘子和板井中去除涂层溶液，并添加适当体积的预热分化介质。
将预热分化介质添加到 15 毫升锥形管中。快速将细胞解冻至室温。解冻后，立即将电池悬浮液转移到锥形离心管。
在300g下离心5分钟。吸气介质，并在分化介质中重新暂停细胞颗粒，以去除任何低温保存介质。以每平方厘米4万至5万个细胞的密度，将细胞镀在分型介质的预涂盘上。
将细胞保持在37摄氏度的5%CO2下，每周更换三次分化介质。在Laminin-521上，未分化的高质量喂食器自由人类多能干细胞首先形成具有锋利的边缘的不同菌落，在汇合时合并成同质的单层。在基础诱导介质中，辅以5微摩尔血红蛋白24小时通常产生各种大小的紧密、常规胚胎体悬浮体，而胚胎体形态在悬浮液表面异体诱导期间不应发生显著变化，在胚胎体被镀到四型胶原蛋白和拉米宁-521组合基质中，发现殖民地外产会很快出现。
在分化的21至25天内，细胞形成汇合均匀的均匀层，具有多边形形态，这是上皮细胞的典型特征。然后，这些细胞可以冷冻储存起来供以后使用，因为解冻后，生存能力和形态都保存完好。在分化的第24天，绝大多数细胞表示成对盒蛋白，PAX6，眼睛发育的关键调节器，以及p63 alpha，广泛认可的LESC标记。
Delta Np63 在大多数 p63 alpha 阳性细胞中共同表达， 确认最角膜特异性增量 Np63 alpha 阳性细胞表型.其他标记部分表达，而其他标记在这一点上是检测不到的，表明分化已经进展到非全权边缘上皮祖细胞，但最终分化到成熟的角膜上皮细胞尚未发生。平均而言，每个未分化的喂食器自由人类多能干细胞在25日产生0.7个细胞。
第24天，至少预计有65%的三角洲Np63α阳性细胞量。冷冻保存进一步净化细胞群体。总体而言，此处介绍的方法相对简单，但有一些成功的关键点。
高品质的起始材料是必不可少的，以及温和，流利的细胞培养技术一般。该协议为临床应用和各种研究目的提供强大的方法，用于生产肢体上皮干细胞。此外，该方法可以很容易地修改，以分化视网膜色素上皮细胞。
