Questo protocollo ha introdotto un metodo definito privo di cellule feeder per differenziare le cellule staminali epiteliali limbali corneali dalle cellule staminali pluripotenti umane. Le cellule staminali epiteliali limbali sono responsabili del rinnovo dell'epiteliale corneale nell'occhio sano. Il danno a queste cellule porta a una condizione nota come carenza di cellule staminali limbali e alla perdita di chiarezza corneale.
I metodi di coltura cellulare qui mostrati consentono una produzione efficiente di cellule staminali epiteliali limbali per future terapie sostitutive delle cellule corneali. Per iniziare, passare e mantenere l'alimentatore libero coltura di cellule staminali pluripotenti umane come delineato nel protocollo di testo. Assicurarsi di utilizzare solo cellule staminali pluripotenti umane di alta qualità come materia prima per le differenziazioni.
Quando è pronto a indurre la formazione del corpo embrionale, riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare. Staccare le cellule staminali pluripotenti umane libere dall'alimentatore alla sospensione aggiungendo 500 microlitri di EDTA di tripina senza xeno ad ogni pozzo. Un'incubazione a 37 gradi Celsius, con 5%CO2.
Dopo tre minuti, rimuovere le cellule dall'incubatore e controllare la morfologia cellulare per determinare la fase ottimale per la rimozione della tripina. Osservare attentamente le cellule per determinare il tempo ottimale per rimuovere l'EDTA tryspin senza xeno, quando le cellule si sono arrotondate per eccesso, ma non si sono staccate completamente. Al momento ottimale, rimuovere l'EDTA di tripina senza xeno dalle cellule.
Aggiungere l'inibitore della tripside definita e pipettare delicatamente per staccare le cellule. Raccogliere la sospensione a cella singola in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Centrifuga a 300g per cinque minuti.
Quindi, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura. Dopo aver contato le cellule, distribuire da due a tre milioni di cellule in tre millilitri di mezzo di induzione basale integrati con cinque blebbistatina micromolare ad ogni pozzo di un basso attacco sei piastre di pozzo. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.
Il giorno dopo, controlla la qualità dei corpi embrioidi al microscopio. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con tre millilitri di mezzo di induzione basale integrati con 10 micromolari SB-505124 e 50 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita umano di base in fibra di vetro. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.
I due giorni seguenti, rimuovere il mezzo e sostituirlo con tre millilitri di mezzo di induzione basale, integrati con 25 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro. Quindi, continua l'incubazione usando le condizioni precedenti. Il quarto giorno, preparare una miscela di 0,5 microgrammi per centimetro quadrato di Laminin-521 e cinque microgrammi per centimetro quadrato di collagene placentare umano di tipo quattro, diluito in DPBS contenente calcio due e magnesio due ioni.
Utilizzando questa miscela, rivestire i piatti di coltura tissutale da 100 millimetri per una differenziazione aderente nel volume totale del rivestimento di cinque millilitri per piatto. Sigillare i piatti e conservarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Il quinto giorno, riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare.
Successivamente, rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 10 millilitri di mezzo di differenziazione pre-riscaldato ad ogni piatto. Utilizzando una pipetta, trasferire i corpi embrionale da un singolo piatto ben attraverso due o tre piatti di coltura tissutale. Quindi, scuoti delicatamente ogni piatto di coltura per distribuire uniformemente i corpi embrioidi.
Mantenere le cellule in coltura aderente a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per le prossime due settimane e mezzo o tre settimane, assicurandosi di sostituire il mezzo con 10 millilitri di mezzo di differenziazione fresco tre volte a settimana. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase per controllare regolarmente le cellule per l'emergere di una corretta morfologia epiteliale. Per iniziare, pre-riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente in una cappa di flusso laminare, ad eccezione del mezzo di crioconservazione, che dovrebbe essere pre-refrigerato.
Successivamente, staccare le cellule staminali epiteliali limbali derivate dalla cellula pluripotente umana alla sospensione a singola cellula aggiungendo EDTA di tripina senza xeno e incubando a 37 gradi Celsius con il 5%CO2. Dopo cinque minuti, rimuovere le cellule dall'incubatore e controllare la morfologia cellulare per determinare la fase ottimale per la rimozione della tripina. Osservare attentamente le cellule per determinare il tempo ottimale per rimuovere l'EDTA di tripina senza xeno, quando le cellule si sono arrotondate per eccesso, ma non si sono staccate completamente.
Nel momento ottimale, rimuovere l'EDTA di tripina senza xeno dalle cellule e staccare le cellule come descritto in precedenza. Dopo aver contato le cellule, centrifugarle a 300 g per cinque minuti. Aspirare il mezzo e rimorsipare le cellule in mezzo di crioconservazione senza xeno pre-refrigerato.
Utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione a cella singola in criotubi in modo che ogni criotubo contenga da 500.000 a un milione di cellule in un millilitro di mezzo di crioconservazione. Posizionare i tubi in un contenitore di congelamento. Entro cinque minuti, trasferirli in un congelatore a -80 gradi Celsius per la conservazione notturna.
Il giorno successivo, trasferire i tubi in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine. Prima di scongelare le cellule, rivestire tutti i piatti e i pozzi di piastra necessari con una miscela di cinque microgrammi per centimetro quadrato di collagene placentare umano di tipo quattro e 0,5 microgrammi per centimetro quadrato di LM-521 e pre-riscaldare tutti i materiali e i reagenti necessari a temperatura ambiente nel cappuccio di flusso laminare. Successivamente, rimuovere la soluzione di rivestimento dai piatti e dai pozzali di piastra e aggiungere il volume appropriato del mezzo di differenziazione preri warmed.
Aggiungere il mezzo di differenziazione preri riscaldato a un tubo conico da 15 millilitri. Scongelare rapidamente le cellule a temperatura ambiente. Una volta scongelato, trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo di centrifuga conico.
Centrifuga a 300g per cinque minuti. Aspirare il mezzo e rimospendare il pellet cellulare in mezzo di differenziazione per rimuovere qualsiasi mezzo di crioconservazione. Placcare le cellule su piatti prerivestiti in mezzo di differenziazione ad una densità da 40.000 a 50.000 cellule per centimetro quadrato.
Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius al 5%CO2, sostituendo il mezzo di differenziazione tre volte a settimana. Su Laminin-521, le cellule staminali pluripotenti umane libere da alimentatore di alta qualità indifferenziate formano prima colonie distinte con spigoli vivi, che si fondono a monostrati omogenei alla confluenza. La coltivazione nel mezzo di induzione basale, integrata con cinque blebbistatina micromolare per 24 ore, produce tipicamente una sospensione di corpi embrionale stretti e regolari di varie dimensioni, mentre la morfologia del corpo embrionale non dovrebbe cambiare drasticamente durante l'induzione ectodermica superficiale in sospensione, la crescita esterna coloniale appare poco dopo che i corpi embrioidi sono placcati sul collagene di tipo quattro e la matrice combinata Laminin-521 nel mezzo di differenziazione.
Entro 21-25 giorni dalla differenziazione, le cellule formano strati omogenei confluenti, con morfologia poligonale, che è tipica delle cellule epiteliali. Le cellule possono quindi essere conservate crio immagazzinate per un uso successivo, poiché la vitalità e la morfologia sono ben conservate dopo lo scongelamento. Al giorno 24 della differenziazione, la stragrande maggioranza delle cellule esprimeva proteina box accoppiata, PAX6, il regolatore chiave dello sviluppo oculare, così come p63 alpha, il marcatore LESC ampiamente riconosciuto.
Delta Np63 è coespresso nella maggior parte delle cellule alfa positive p63, confermando il fenotipo di cellula alfa positivo delta Np63 più specifico della cornea. Altri marcatori sono espressi in parte, mentre altri non sono rilevabili a questo punto, indicando che la differenziazione è progredita verso i progenitori epiteliali limbali unipotenti, ma la differenziazione terminale in cellule epiteliali corneali mature non si è ancora verificata. In media, ogni cellula staminale pluripotente umana priva di alimentatore indifferenziato genera 0,7 cellule entro il giorno 25.
Almeno il 65% delta Np63 popolazione di cellule alfa positive può essere prevista entro il giorno 24. La crioconservazione purifica ulteriormente la popolazione cellulare. Nel complesso, i metodi qui presentati sono relativamente semplici, ma ci sono alcuni punti critici per il successo.
L'alta qualità del materiale di partenza è essenziale, così come le tecniche di coltura cellulare dolci e fluenti in generale. Questo protocollo fornisce mezzi robusti per produrre cellule staminali epiteliali limbali per applicazioni cliniche, nonché per vari scopi di ricerca. Inoltre, il metodo può essere facilmente modificato per la differenziazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche.
