Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinden kornea limbal epitel kök hücrelerini ayırt etmek için tanımlanmış bir besleyici hücre siz yöntem tanıttı. Limbal epitel kök hücreleri sağlıklı gözde kornea epitel yenilenmesi nden sorumludur. Bu hücrelere zarar limbal kök hücre eksikliği olarak bilinen bir duruma yol açar, ve kornea berraklığı kaybına.
Burada gösterilen hücre kültürü yöntemleri gelecekteki kornea hücre replasman tedavileri için limbal epitel kök hücrelerin verimli üretimini sağlar. Başlamak için, geçiş ve metin protokolünde belirtildiği gibi besleyici ücretsiz insan pluripotent kök hücre kültürü korumak. Farklılaştırmalar için başlangıç malzemesi olarak sadece yüksek kaliteli insan pluripotent kök hücreleri kullandığınızdan emin olun.
Embriyoid vücut oluşumunu teşvik etmeye hazır olduğunuzda, gerekli tüm malzemeleri ve reaktifleri bir laminar akış kaputunda oda sıcaklığına ısıtın. Besleyici ücretsiz insan pluripotent kök hücreleri süspansiyon için her kuyuya 500 mikrolitre xeno ücretsiz tripsin EDTA ekleyerek ayırın. %5 CO2 ile 37 santigrat derecede kuluçka.
Üç dakika sonra, inkübatör hücreleri çıkarın ve tripsin çıkarılması için en uygun fazbelirlemek için hücre morfolojisi kontrol edin. Hücreler toplandığında, ancak tamamen ayrılmadığında, xeno free tryspin EDTA'yı kaldırmak için en uygun zamanı belirlemek için hücreleri dikkatle gözlemleyin. En uygun zamanda, hücrelerden xeno serbest tripsin EDTA çıkarın.
Hücreleri ayırmak için tanımlanmış tripsin inhibitörü ve hafifçe pipet ekleyin. 50 mililitrelik bir santrifüj tüp tek hücreli süspansiyon toplamak. Santrifüj 300g beş dakika için.
Sonra, supernatant kaldırmak ve kültür ortamının bir mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri sayarak sonra, bazal indüksiyon orta üç mililitre de düşük bir eki altı iyi plaka her kuyuya beş mikromolar blebbistatin ile takviye iki ila üç milyon hücre dağıtmak. Bir gecede %5 CO2 ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yat.
Ertesi gün, mikroskop altında embriyoid cisimlerin kalitesini kontrol edin. Orta çıkarın ve bazal indüksiyon orta üç mililitre ile değiştirin 10 mikromolar SB-505124 ve 50 insan temel fiberglas büyüme faktörü mililitre başına nanogram ile desteklenmiştir. %5 CO2 ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın.
Aşağıdaki iki gün, orta kaldırmak ve bazal indüksiyon orta üç mililitre ile değiştirin, kemik morfogenetik protein dört mililitre başına 25 nanogram ile takviye. Daha sonra, önceki koşulları kullanarak kuluçkaya devam edin. Dördüncü gün, Laminin-521 santimetre kare başına 0.5 mikrogram ve insan plasental kollajen tip dört santimetre kare başına beş mikrogram, kalsiyum iki ve magnezyum iki iyon içeren DPBS seyreltilmiş bir karışım hazırlamak.
Bu karışımı kullanarak, çanak başına beş mililitre toplam kaplama hacmi nde yapışık farklılaşma için 100 milimetre doku kültürü yemekleri katlayın. Plakaları kapatın ve bir gecede dört derece santigrat derecede saklayın. Beşinci gün, gerekli tüm malzemeleri ve reaktifleri bir laminar akış kaputunda oda sıcaklığına ısıtın.
Bundan sonra, kaplama çözeltisini çıkarın ve her çanağa önceden ısıtılmış diferansiyasyon ortamı 10 mililitre ekleyin. Bir pipet kullanarak, embriyoid bedenleri tek bir tabaktan iki ila üç doku kültürü yemeğine aktarın. Sonra, yavaşça eşit embriyoid organları dağıtmak için her kültür çanak sallamak.
Sonraki iki buçuk ila üç hafta boyunca %5 CO2 ile 37 santigrat derecede yapışık kültürdeki hücreleri koruyun ve ortamı haftada üç kez 10 mililitre taze farklılaşma ortamıyla değiştirmeyi unutmayın. Doğru epitel morfolojisinin ortaya çıkması için hücreleri düzenli olarak kontrol etmek için bir faz kontrast mikroskobu kullanın. Başlamak için, önceden soğutulması gereken kriyopreservation ortam dışında, bir laminar akış kaputunda oda sıcaklığına gerekli tüm malzeme ve reaktifler önceden ısıtın.
Daha sonra, insan pluripotent kök hücre tek hücre süspansiyon xeno serbest trippsin EDTA ekleyerek ve% 5 CO2 ile 37 derece santigrat de kuluçka limbal epitel kök hücreleri elde ayırın. Beş dakika sonra, inkübatör hücreleri çıkarın ve tripsin çıkarılması için en uygun fazbelirlemek için hücre morfolojisi kontrol edin. Hücreler toplandığında, ancak tamamen ayrılmadığında, xeno serbest tripsin EDTA'yı çıkarmak için en uygun zamanı belirlemek için hücreleri dikkatle gözlemleyin.
En uygun zamanda, hücrelerden xeno serbest tripsin EDTA'yı çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi hücreleri ayırın. Hücreleri sayarak sonra, beş dakika için 300g onları santrifüj. Orta aspire ve önceden soğutulmuş xeno serbest kriyopreservation orta hücreleri resuspend.
Bir pipet kullanarak, tek hücreli süspansiyonu kriyo-tüplere aktarın, böylece her kriyo-tüp bir mililitre kriyopreservation ortamda 500,000 ila bir milyon hücre içerir. Tüpleri dondurucu bir kapta yerleştirin. Beş dakika içinde, bir gecede depolama için negatif 80 santigrat derecede bir dondurucuya aktarın.
Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın. Hücreleri eritmeden önce, santimetre kare insan plasenta kollajen tip dört başına beş mikrogram karışımı ile tüm gerekli tabak ve plaka kuyuları kat ve LM-521 santimetre kare başına 0,5 mikrogram, ve önceden gerekli tüm malzeme ve reaktifler laminar akış kaputunda oda sıcaklığına ısıtın. Daha sonra, kaplama çözeltisini tabaklardan ve tabak kuyularından çıkarın ve önceden ısıtılmış farklılaşma ortamının uygun hacmini ekleyin.
Önceden ısıtılmış farklılaşma ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığına kadar hızlı bir şekilde eritin. Çözüldükten sonra, hemen konik santrifüj tüpü ne hücre süspansiyon aktarın.
Santrifüj 300g beş dakika için. Aspirasyon orta, ve herhangi bir kriyopreservation orta kaldırmak için farklılaşma orta hücre pelet resuspend. Hücreleri 40, 000 ila 50, 000 hücre kare santimetre kare lik bir yoğunlukta, farklılaşma ortamında önceden kaplanmış tabaklara yerleştirin.
Hücreleri haftada üç kez farklılaşma ortamının yerine %5 CO2'de 37 derecede koruyun. Laminin-521'de, farklılaşmamış yüksek kaliteli besleyici siz insan pluripotent kök hücreleri ilk olarak keskin kenarlı farklı koloniler oluştururlar ve bu koloniler birleştiğinde homojen tek katmanlara bağlanır. Bazal indüksiyon ortamda Culturing, 24 saat boyunca beş mikromolar blebbistatin ile takviye genellikle çeşitli boyutlarda sıkı, düzenli embriyoid organların bir süspansiyon üretir, embriyoid vücut morfolojisi süspansiyon yüzey ektodermal indüksiyon sırasında önemli ölçüde değişmemelidir ise, kolonyal büyüme kısa bir süre sonra embriyoid organları kollajen tip dört ve Laminin-521 farklı matris kombinasyonu üzerine plakalı görünür.
Farklılaşmadan sonraki 21 ila 25 gün içinde hücreler, epitel hücrelerine özgü poligonal morfolojisi ile birlikte, eşzamanlı homojen tabakalar oluştururlar. Canlılık ve morfoloji iyi çözülme sonra korunur gibi hücreler daha sonra kullanmak için kriyo saklanabilir. Gün 24 farklılaşma, hücrelerin büyük çoğunluğu eşleştirilmiş kutu protein ifade, PAX6, göz gelişiminin temel düzenleyici, yanı sıra p63 alfa, yaygın olarak tanınan LESC marker.
Delta Np63 p63 alfa pozitif hücrelerin çoğunda coexpressed, en kornea spesifik delta Np63 alfa pozitif hücre fenotip doğrulayan. Diğer belirteçler kısmen ifade edilirken, diğerleri bu noktada saptanamaz, farklılaşma nın tek yönlü limbal epitel atalarına doğru ilerlediğini gösterir, ancak olgun kornea epitel hücrelerine terminal farklılaşma henüz gerçekleşmemiştir. Ortalama olarak, her farklılaşmamış besleyici ücretsiz insan pluripotent kök hücre gün 25 tarafından 0.7 hücre üretir.
En az%65 delta Np63 alfa pozitif hücre popülasyonu 24. Kriyoprezervasyon hücre popülasyonunu daha da arındırır. Genel olarak, burada sunulan yöntemler nispeten basittir, ancak başarı için birkaç kritik nokta vardır.
Başlangıç malzemesinin yüksek kalitesi, genel olarak nazik, akıcı hücre kültürü tekniklerinin yanı sıra esastır. Bu protokol, klinik uygulamalar için limbal epitel kök hücrelerinin yanı sıra çeşitli araştırma amaçları için de güçlü araçlar sağlar. Ayrıca, yöntem kolayca retinal pigment epitel hücrelerinin farklılaşması için değiştirilebilir.
