Dieses Protokoll führte eine definierte zellfreie Methode zur Differenzierung von kornealen limbalen Epithelstammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen ein. Limbalepitheliale Stammzellen sind verantwortlich für die Erneuerung des Hornhautepithels im gesunden Auge. Schäden an diesen Zellen führen zu einem Zustand, der als limbaler Stammzellmangel bekannt ist, und zum Verlust der Hornhautklarheit.
Die hier gezeigten Zellkulturmethoden ermöglichen eine effiziente Produktion von limbalepitheliaalen Stammzellen für zukünftige Hornhautzellersatztherapien. Um die im Textprotokoll beschriebene zu beginnen, zu durchgehen und zu pflegen, wird die zubringerfreie menschliche pluripotente Stammzellkultur beibehalten. Achten Sie darauf, nur hochwertige menschliche pluripotente Stammzellen als Ausgangsmaterial für Differenzierungen zu verwenden.
Wenn Sie bereit sind, die embryoide Körperbildung zu induzieren, wärmen Sie alle benötigten Materialien und Reagenzien auf Raumtemperatur in einer laminaren Strömungshaube. Lösen Sie den Feeder freie menschliche pluripotente Stammzellen auf die Suspension, indem Sie 500 Mikroliter xeno freies Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzufügen. Eine Inkubation bei 37 Grad Celsius, mit 5% CO2.
Entfernen Sie nach drei Minuten die Zellen aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Zellmorphologie, um die optimale Phase für die Trypsinentfernung zu bestimmen. Beobachten Sie die Zellen sorgfältig, um die optimale Zeit zu bestimmen, um den xeno freien Tryspin EDTA zu entfernen, wenn die Zellen aufgerundet haben, aber nicht vollständig abgetrennt haben. Zum optimalen Zeitpunkt entfernen Sie die xeno freie Trypsin EDTA aus den Zellen.
Fügen Sie definierte Trypsin-Inhibitor und sanft Pipette, um die Zellen zu lösen. Sammeln Sie die Einzelzellsuspension in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 300g für fünf Minuten.
Entfernen Sie dann den Überstand, und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Kulturmedium wieder aus. Nach dem Zählen der Zellen, verteilen Sie zwei bis drei Millionen Zellen in drei Milliliter nbisceinem Induktionsmedium, ergänzt mit fünf mikromolaren Blebbistatin, an jeden Brunnen einer niedrigen Aufsatz-Sechs-Well-Platte. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 inkubieren.
Überprüfen Sie am nächsten Tag die Qualität der embryoiden Körper unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Medium, und ersetzen Sie es durch drei Milliliter Basalinduktionsmedium ergänzt mit 10 Mikromolar SB-505124 und 50 Nanogramm pro Milliliter des menschlichen Basis-Glasfaser-Wachstumsfaktors. Bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 weiter inkubieren.
Entfernen Sie in den folgenden zwei Tagen das Medium und ersetzen Sie es durch drei Milliliter Basalinduktionsmedium, ergänzt durch 25 Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein vier. Fahren Sie dann mit den vorherigen Bedingungen fort. Am vierten Tag eine Mischung aus 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter Laminin-521 und fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter menschlichem Plazentakollagen Typ 4 zubereiten, verdünnt in DPBS, die Kalzium zwei und Magnesium zwei Ionen enthalten.
Mit dieser Mischung beschichten Sie die 100 Millimeter Gewebekulturschalen zur haftenden Differenzierung im Gesamtbeschichtungsvolumen von fünf Millilitern pro Schale. Versiegeln Sie die Teller und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius über Nacht. Am fünften Tag alle benötigten Materialien und Reagenzien in einer laminaren Durchflusshaube auf Raumtemperatur erwärmen.
Danach entfernen Sie die Beschichtungslösung und fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes Differenzierungsmedium zu jeder Schale hinzu. Mit einer Pipette die embryoiden Körper von einer einzigen Platte gut über zwei bis drei Gewebekulturgerichte übertragen. Dann schütteln Sie vorsichtig jedes Kulturgericht, um die embryonalen Körper gleichmäßig zu verteilen.
Halten Sie die Zellen in der anhaftenden Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 für die nächsten zweieinhalb bis drei Wochen, stellen Sie sicher, das Medium durch 10 Milliliter frische Differenzierung Medium dreimal pro Woche zu ersetzen. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop, um die Zellen regelmäßig auf die Entstehung einer korrekten Epithelmorphologie zu überprüfen. Zunächst sollten alle benötigten Materialien und Reagenzien in einer laminaren Durchflusshaube auf Raumtemperatur vorgewärmt werden, mit Ausnahme des Kryokonservierungsmediums, das vorgekühlt werden sollte.
Als nächstes lösen Sie die menschliche pluripotente Stammzelle abgeleitet elimbal epitheliale Stammzellen zu einzelzellierSuspension durch Zugabe von xeno freien Trypsin EDTA und Inkubation bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2. Entfernen Sie nach fünf Minuten die Zellen aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Zellmorphologie, um die optimale Phase für die Trypsinentfernung zu bestimmen. Beobachten Sie die Zellen sorgfältig, um die optimale Zeit zu bestimmen, um die xeno freie Trypsin EDTA zu entfernen, wenn die Zellen aufgerundet haben, aber nicht vollständig abgetrennt haben.
Entfernen Sie zum optimalen Zeitpunkt die xenofreie Trypsin-EDTA aus den Zellen, und lösen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben. Nach dem Zählen der Zellen zentrieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300g. Das Medium ansaugen und die Zellen in vorgekühltem xeno freiem Kryokonservierungsmedium wieder aussetzen.
Mit einer Pipette die einzellige Suspension in Kryoröhren übertragen, so dass jedes Kryorohr zwischen 500.000 und einer Million Zellen in einem Milliliter Kryokonservierungsmedium enthält. Legen Sie die Rohre in einen Gefrierbehälter. Innerhalb von fünf Minuten, übertragen Sie sie in einen Gefrierschrank bei negativen 80 Grad Celsius für die Nachtlagerung.
Am nächsten Tag die Rohre zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff übertragen. Vor dem Auftauen der Zellen alle benötigten Geschirre und Tellerbrunnen mit einer Mischung aus fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter menschlichem Plazentakollagen Typ vier und 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter LM-521 beschichten und alle benötigten Materialien und Reagenzien auf Raumtemperatur in der laminaren Strömungshaube vorwärmen. Als nächstes entfernen Sie die Beschichtungslösung aus den Tellern und Tellerbrunnen und fügen Sie das entsprechende Volumen des vorgewärmten Differenzierungsmediums hinzu.
Fügen Sie ein vorgewärmtes Differenzierungsmedium zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu. Tauen Sie die Zellen schnell auf Raumtemperatur. Nach dem Auftauen die Zellsuspension sofort in das konische Zentrifugenrohr übertragen.
Zentrifuge bei 300g für fünf Minuten. Saugen Sie das Medium, und setzen Sie das Zellpellet in Differenzierungsmedium, um jedes Kryokonservierungsmedium zu entfernen. Die Zellen in Differenzierungsmedium mit einer Dichte von 40 000 bis 50 000 Zellen pro Quadratzentimeter auf vorbeschichtete Schalen aufteilen.
Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2, ersetzen Sie das Differenzierungsmedium dreimal pro Woche. Bei Laminin-521 bilden die undifferenzierten, hochwertigen, pluripotenten Stammzellen zunächst unterschiedliche Kolonien mit scharfen Kanten, die bei zusammenfließen. Das Kultivieren in einem basalen Induktionsmedium, ergänzt durch fünf Mikromolar-Blebbistatin für 24 Stunden, erzeugt in der Regel eine Suspension von engen, regelmäßigen embryoiden Körpern unterschiedlicher Größe, während sich die embryoiden Körpermorphologie während der ektodermalen Oberflächeninduktion in der Suspension nicht dramatisch ändern sollte, das koloniale Auswuchs tritt bald nach der Präzisierung der embryoiden Körper auf die Kollagen-Typ-4 und die Laminin-521-Kombination in der Differenzierungs-Kombination.
Innerhalb von 21 bis 25 Tagen nach der Differenzierung bilden die Zellen konfluente homogene Schichten mit polygonaler Morphologie, die typisch für Epithelzellen ist. Die Zellen können dann kryo für die spätere Verwendung gespeichert werden, da Lebensfähigkeit und Morphologie nach dem Auftauen gut erhalten sind. Am 24. Tag der Differenzierung exprimierte die überwiegende Mehrheit der Zellen gepaartes Boxprotein, PAX6, den wichtigsten Regulator der Augenentwicklung, sowie p63 alpha, den weithin anerkannten LESC-Marker.
Delta Np63 wird in den meisten p63 alpha-positiven Zellen koexprimiert und bestätigt den hornartartreichsten Delta-Np63-Alpha-positiven Zellphänotyp. Andere Marker werden teilweise exprimiert, während andere an dieser Stelle nicht nachweisbar sind, was darauf hindeutet, dass die Differenzierung in Richtung der einpotenten limbalen Epitheliden-Vorläufer fortschritten, aber die terminale Differenzierung in reife Hornhautepithelzellen ist noch nicht eingetreten. Im Durchschnitt erzeugt jede undifferenzierte Feederfreie menschliche pluripotente Stammzelle 0,7 Zellen pro Tag 25.
Mindestens 65%Delta Np63 alpha positive Zellpopulation kann bis Tag 24 erwartet werden. Die Kryokonservierung reinigt die Zellpopulation weiter. Insgesamt sind die hier vorgestellten Methoden relativ einfach, aber es gibt einige kritische Punkte für den Erfolg.
Eine hohe Qualität des Ausgangsmaterials ist ebenso wichtig wie schonende, fließende Zellkulturtechniken im Allgemeinen. Dieses Protokoll bietet robuste Mittel zur Herstellung von limbalepitheliaalen Stammzellen für klinische Anwendungen sowie für verschiedene Forschungszwecke. Darüber hinaus kann die Methode leicht zur Differenzierung von retinalen Pigmentepithelzellen modifiziert werden.
