이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포로부터 각막 사지 상피 줄기 세포를 분화하기 위한 정의된 피더 세포 무료 방법을 도입하였다. 림팔 상피 줄기 세포는 건강한 눈에서 각막 상피를 갱신할 책임이 있습니다. 이 세포에 손상은 사지 줄기 세포 결핍으로 알려져 있는 조건에 지도하고, 각막 선명도의 손실로 이끌어 냅니다.
여기에 표시된 세포 배양 방법은 미래의 각막 세포 대체 요법을 위한 사지 상피 줄기 세포의 효율적인 생산을 가능하게 합니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 피더 가 없는 인간 만능 줄기 세포 배양을 통과하고 유지한다. 분화를 위한 시작 재료로 고품질의 인간 만능 줄기 세포만 사용해야 합니다.
배아 체형성을 유도할 준비가 되면 필요한 모든 재료와 시약을 라미나르 플로우 후드의 실온으로 데워보세요. 피더 무료 인간 만능 줄기 세포를 각 우물에 xeno 무료 트립신 EDTA 500 마이크로리터를 추가하여 서스펜션에 분리합니다. 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이팅.
3분 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 세포 형태를 확인하여 트립신 제거를 위한 최적의 단계를 결정합니다. 세포를 주의 깊게 관찰하여 세포가 반올림되었지만 완전히 분리되지 않은 경우 xeno 무료 tryspin EDTA를 제거하는 최적의 시간을 결정합니다. 최적의 시간에, 세포에서 제노 무료 트립신 EDTA를 제거합니다.
정의된 트립신 억제제와 부드럽게 파이펫을 추가하여 세포를 분리합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 단일 세포 현탁액을 수집합니다. 300g의 원심분리기는 5분간.
그런 다음, 상체를 제거하고 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 세포를 계산한 후, 5개의 마이크로몰라 블비스타틴으로 보충된 기저 유도 매체의 3밀리리터에 2~300만 개의 세포를 낮은 부착 6웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 하룻밤 사이에 37도에서 5%의 CO2로 배양합니다.
다음 날, 현미경의 밑에 태아 바디의 질을 확인합니다. 매체를 제거하고, 인간 기본 유리 섬유 성장 인자의 밀리리터 당 10 마이크로 몰러 SB-505124 및 50 나노그램으로 보충 된 기저 유도 매체의 3 밀리리터로 대체하십시오. 5%의 CO2로 섭씨 37도에서 계속 배양하십시오.
다음 이틀, 배지를 제거하고, 뼈 형태 유전학 단백질 4의 밀리리터 당 25 나노 그램으로 보충, 기저 유도 매체의 3 밀리리터로 대체. 그런 다음 이전 조건을 사용하여 인큐베이션을 계속합니다. 4일째에는 라미닌-521의 평방 센티미터당 0.5 마이크로그램과 4형의 1제곱미터당 5마이크로그램을 칼슘 2개와 마그네슘 2개를 함유한 DPBS로 희석한다.
이 혼합물을 사용하여 100mm 조직 배양 접시를 코팅하여 접시 당 5 밀리리터의 총 코팅 부피를 억제합니다. 접시를 밀봉하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 5일째에는 필요한 재료와 시약을 라미나르 플로우 후드로 실온으로 데워보실.
그 후 코팅 용액을 제거하고 각 접시에 미리 따뜻해지는 분화 매체 10 밀리리터를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 배아 시체를 단일 플레이트에서 2~3개의 조직 배양 접시에 걸쳐 잘 전달합니다. 그런 다음 각 문화 접시를 부드럽게 흔들어 배아 체를 고르게 분배합니다.
다음 2~3주 동안 섭씨 37도에서 세포를 5%CO2로 유지하여 배지를 일주일에 3회 신선한 분화 배지10밀리리터로 교체하십시오. 상 대비 현미경을 사용하여 정확한 상피 형태학의 출현을 정기적으로 세포를 확인하십시오. 먼저, 미리 냉각되어야 하는 냉동 보존 매체를 제외하고, 라미나르 유동 후드의 실온에 필요한 모든 재료와 시약을 미리 데우기 위해 미리 데워야 한다.
다음으로, 인간 다능성 줄기 세포를 분리하여 제노 프리 트립신 EDTA를 추가하고 5%CO2로 섭씨 37도에서 배양함으로써 단세포 현탁액에 대한 변전성 상피 줄기 세포를 분리한다. 5 분 후, 인큐베이터에서 세포를 제거하고 트립신 제거를위한 최적의 단계를 결정하기 위해 세포 형태를 확인합니다. 세포를 주의 깊게 관찰하여 세포가 반올림되었지만 완전히 분리되지 않은 경우 xeno 무료 트립신 EDTA를 제거하는 최적의 시간을 결정합니다.
최적의 시간에, 세포에서 제노 무료 트립신 EDTA를 제거하고, 앞에서 설명한 바와 같이 세포를 분리한다. 세포를 계산한 후 원심분리기는 5분 동안 300g으로 분리합니다. 배지를 흡인시키고, 미리 냉각된 제노 자유 냉동 보존 배지에서 세포를 재분리한다.
파이펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 냉동튜브로 전송하여 각 저온 튜브가 냉동 보존 배지의 1 밀리리터에 500, 000에서 백만 개의 세포를 포함하도록 합니다. 튜브를 냉동 용기에 놓습니다. 5분 이내에 하룻밤 동안 섭씨 80도의 냉동고로 옮기면 보관하십시오.
다음 날, 장기 저장을 위해 튜브를 액체 질소로 옮깁니다. 세포를 해동하기 전에, LM-521의 평방 센티미터 당 5 마이크로 그램과 LM-521의 평방 센티미터 당 0.5 마이크로 그램의 혼합물로 필요한 모든 요리와 접시 우물을 코팅하고, 라미나르 흐름 후드의 실온에 필요한 모든 재료와 시약을 미리 따뜻하게. 다음으로, 접시 및 플레이트 우물에서 코팅 용액을 제거하고 미리 데워진 분화 매체의 적절한 부피를 추가합니다.
15 밀리리터 원모형 튜브에 미리 데워진 분화 매체를 추가합니다. 세포를 실온으로 빠르게 해동합니다. 일단 해동되면, 즉시 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.
300g의 원심분리기는 5분간. 배지를 흡인하고, 분화 배지에서 세포 펠릿을 재분리하여 극저온 배지를 제거한다. 세포를 40, 000 ~ 50, 평방 센티미터당 000 셀의 밀도로 분화 배지에서 미리 코팅 된 접시에 접시를 접시.
세포를 섭씨 37도에서 5%CO2로 유지하여 분화 매체를 일주일에 세 번 교체한다. Laminin-521에서, 미분화 된 고품질 피더 무료 인간 만능 줄기 세포는 먼저 날카로운 가장자리와 뚜렷한 식민지를 형성, 이는 합류 시 균일 한 단층에 병합. 기저 유도 배지에서 배양, 24시간 동안 5개의 미세몰라 블비스타틴으로 보충된 배아 체형은 전형적으로 다양한 크기의 타이트하고 정기적인 배아 체의 현탁액을 생성하며, 배아 체형태는 현탁액의 표면 이복증 유도 중에 극적으로 변화해서는 안되며, 식민지 외성장은 콜라겐 형 에 판상이 있는 4개의 배아학적 조합에 소판된 직후나타나는 것으로 보인다.
분화의 21 에서 25 일 안에, 세포는 상피 세포에 전형적인 다각형 형태와 함께, 응석 균질 층을 형성합니다. 생존력과 형태는 해동 후 잘 보존되기 때문에 세포는 나중에 사용하기 위해 저장될 수 있다. 분화의 24일째에, 세포의 대다수는 쌍이 있는 상자 단백질, PAX6, 눈 발달의 주요 레귤레이터, 뿐 아니라 p63 알파, 널리 인정되는 LESC 마커를 표현했습니다.
Delta Np63는 대부분의 p63 알파 양성 셀에서 코표현되어 가장 각막 특이적 델타 Np63 알파 양성 세포 표현형을 확인한다. 다른 마커는 부분적으로 발현되고, 다른 마커는 부분적으로 발현되고, 다른 마커는 이 시점에서 검출할 수 없는 반면, 단호성 사지 상피 전월체쪽으로 분화가 진행되었음을 나타내지만, 성숙한 각막 상피 세포로의 말단 분화는 아직 발생하지 않았다. 평균적으로, 각각의 미분화 피더 무료 인간 만능 줄기 세포는 25일까지 0.7 세포를 생성한다.
적어도 65% 델타 Np63 알파 양성 세포 인구는 24일까지 예상될 수 있습니다. 냉동 보존은 세포 인구를 더욱 정화합니다. 전반적으로 여기에 제시된 방법은 비교적 간단하지만 성공에는 몇 가지 중요한 점이 있습니다.
시팅 재료의 높은 품질은 일반적으로 부드럽고 유창한 세포 배양 기술뿐만 아니라 필수적입니다. 이 프로토콜은 임상 응용 프로그램뿐만 아니라 다양한 연구 목적을 위해 사지 상피 줄기 세포를 생산하는 강력한 수단을 제공합니다. 더욱이, 방법은 망막 색소 상피 세포의 분화를 위해 쉽게 변형될 수 있다.
