marinum 分枝杆菌感染成人斑马鱼结核的建模

这种方法可以帮助回答结核病领域关键问题，如适应性免疫反应的作用和这种多因素疾病的发病机制。这种核酸碱法的主要优点是，细菌载荷和基因表达水平都可以从同一个人中测量。要开始此过程，在文本协议中概述的 7H10 板上培养 M.marinum。

将含有ADC浓缩、多糖80和甘油的7H9介质的10毫升转移到细胞培养瓶中。然后，使用无菌的一微升接种循环无菌地将一个循环的M.marinum细菌质量转移到烧瓶中。松开盖子或使用滤网盖，使气体在29摄氏度的黑暗中有足够的气体交换和培养，在三到四天内不摇晃，直到OD600达到0.7左右。

稀释并继续培养在文本中概述的细菌。要开始准备细菌溶液的感染，转移一毫升培养成一个新的管。在10，000克的离心机，三分钟。

取出上一杯，将颗粒重新在一毫升无菌PBS中。使用无菌PBS与0.3毫克每毫升苯酚红色作为示踪剂，稀释悬浮液，以达到所需的细菌浓度。在此之后，使用一毫升注射器缓慢拉吊架通过27量针三次。

在使用每个等分项之前执行此步骤。首先，将稀释的细菌溶液的五微升液滴移液到一块石蜡薄膜上。然后，将液滴拉入30量量胰岛素针中。

使用五到八个月大的鱼进行这个实验，其中一种是野生鱼，另一种是抹布突变鱼。将这些鱼的腹侧向上放置在一块潮湿的发泡塑料的缝隙中。以 45 度角在骨盆鳍之间注射胰岛素针。

保持针头向上打开，以确保整个开口位于腹腔内。然后，慢慢注射细菌溶液。在此之后，小心地取出针头，并立即将鱼转移到装满新鲜水箱水的回收罐中。

每 15 分钟在 7H10 板上从使用的细菌等分中采集一次样品。在29摄氏度下孵育这些样本5天，以验证感染剂量。定期检查鱼的健康，确保任何有感染症状的鱼通过在水中用超过0.02%的3-氨基苯甲酸乙酯孵育它们来安乐死。

对鱼进行安乐死后，将针后插入枝条。通过尾巴插入第二个针，将鱼钉在平台上。使用手术刀，打开整个腹腔。

然后，用小勺子和锋利的钳子收集从心脏开始，沿着脊柱向尾巴工作的内部器官，将所有内脏器官分离在一个方块中。使用钳子将肠网从丁香中分离出来，将器官转移到含有半打 2.8 毫米陶瓷珠的 1.5 毫升均质管中。立即将管子放在干冰上以冷冻样品。

将样品储存在负80摄氏度，直到准备好均质。提取DNA和RNA后，按文本协议中概述的定量PCR测量分枝杆菌载荷。在这项研究中，成年斑马鱼通过内皮内注射感染了M.marinum。

高感染剂量被认为会导致一种渐进性疾病，其中分枝杆菌负荷继续增加，直到平均负荷达到约500万细菌最终杀死鱼。另一方面，低剂量导致疾病谱的发展，类似于在人类结核病中出现渐进、潜伏、重新激活和绝育感染的疾病谱。在这种情况下，负载继续增加四个星期后，疾病达到稳定状态，在大部分鱼。

这一数据表明，用于感染鱼类的分枝杆菌的初始数量是感染结果的关键决定因素。拉格突变斑马鱼被认为不能充分限制分枝杆菌的生长，导致更高的细菌负荷和更高的发病率。这清楚地表明了适应性免疫在控制分枝杆菌感染方面的重要性。

白细胞-4的含量在野生类型组中要高得多，表明有效引入白细胞素-4需要适应性反应，但在分枝杆菌感染后引入干扰素伽马是可有可无的。该协议允许从同一样本中采集DNA和RNA，从而有可能将样品的分枝杆菌负担与宿主和细菌的基因表达数据相结合。这种技术可以与药物或候选疫苗的给药相结合，以评估其对分枝杆菌负荷和免疫反应的影响。

在尝试此程序时，在使用生物安全二级病原体时，必须记住遵循当地关于人身安全和废物处理的准则。这项技术使得研究在斑马鱼中具有休眠分枝杆菌的活性结核病和潜伏性结核病成为可能，斑马鱼是一种合乎道德的非哺乳动物体内模型。