成人斑马鱼对 DNA 疫苗临床前筛选的免疫研究

我们使用这个协议来寻找新的结核病候选疫苗，但我可以应用于其他传染病。与哺乳动物模型相比，该方法为新型DNA疫苗候选者的初步筛选提供了一种具有成本效益的程序。演示这个程序的将是汉纳莱娜·皮普波，一个来自我们实验室的技术人员。

首先，将玻璃毛细管安装到极性杆中的 V 形槽中，轻轻拧紧夹紧旋钮。将支架移至灯丝旁边，轻轻将毛细管推过灯丝，进入灯丝另一侧的极坐标杆。接下来，拧紧夹紧旋钮，放下安全玻璃，然后按下拉紧按钮。

在此之后，将针头放在培养皿内的可重复使用的粘合剂上，以保护针头尖。首先，使用每剂量0.5至12微克质粒准备注射混合物。为组中的鱼数准备适当的主混合量。

将毛细管针放在适当支架上的胶带粘性侧。接下来，将质粒剂量的移液滴滴滴到一块实验室薄膜上。在此之后，使用加载尖端将质粒滴从薄膜转移到针头中。

缓慢而小心地移液，避免将气泡移入针头。放置微型操纵器和光源。然后将气压水龙头切换到打开位置。

在微型喷油器前面板上，使用分时模式将脉冲长度调整为 10 秒。然后，使用 10 圈周期表盘微调脉冲长度。接下来，将针头放在微型操纵器的微移液器支架上。

使用钳子切割针头，让液体被推出，并使用显微镜评估针头的位置。按一次远程脚部开关，验证一秒脉冲是否将小液滴从针头中推出。然后调整电穿孔器设置，将钳子连接到电穿孔器。

为了在注射过程中使鱼处于固定位置，请使用一块海绵，中间有凹槽，作为衬垫。将海绵彻底浸泡在系统水中，并放在培养皿中。使用塑料勺将麻醉斑马鱼转移到湿海绵中，鱼的腹侧在凹槽中向下。

在显微镜下，将针头以45度角靠近斑马鱼的背部肌肉，然后在背鳍前找到没有鳞片的小点，将针头推入肌肉。如果感觉到任何阻力，请尝试相邻点。使用脚部开关逐渐将质粒溶液注射到肌肉中。

在显微镜下，苯酚红色应可见，因为它进入肌肉组织。注射后，将钳子式电极放在注射部位的每一侧，立即对鱼进行电化。按下电穿孔器上的启动按钮，并给它六个 40 伏 50 毫秒脉冲。

然后，轻轻地将鱼转移到回收罐。最后，根据文本协议对鱼进行一次分析后，使用紫外光在注射部位附近看到EGFP表达式。在此协议中，DNA抗原在表达载体中与GP相邻被克隆。

斑马鱼在肌肉内用微注射器注射DNA抗原质粒，注射部位进行电位化，以改善质粒进入细胞的摄入量。对于成像，抗原表达可以通过荧光显微镜进行可视化。在这种情况下，在注射部位附近检测到所有三种抗原GP融合蛋白的表达，尽管其强度不同。

斑马鱼在接种分枝杆菌抗原五周后感染了马琳分枝杆菌。QPCR用于确定每条鱼在感染后四周的细菌负担。与对照组相比，使用抗原一剂免疫的鱼在感染M.marinum后细菌负荷减少。

在执行该方法时，在大规模实验前对质粒结构进行精心设计，验证抗原的表达，并实践注射技术十分重要。这项技术可以为成人斑马鱼中新型基于DNA的疫苗候选者进行具有成本效益的临床前筛查铺平道路。不要忘记，动物的福利是非常重要的，适当的麻醉是必不可少的，而执行这个程序。