Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Tuberkulose zu beantworten, wie die Rolle der adaptiven Immunantworten und die Pathogenese dieser multifaktoriellen Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Nukleinsäure-Basenmethode besteht darin, dass sowohl bakterielle Belastungen als auch Genexpressionsniveaus von demselben Individuum aus gemessen werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, Kultur M.marinum auf einer 7H10-Platte, wie im Textprotokoll beschrieben.
Übertragen Sie 10 Milliliter 7H9-Medium mit ADC-Anreicherung, Polysorbat 80 und Glycerin in einen Zellkulturkolben. Verwenden Sie dann eine sterile Ein-Mikroliter-Impfschleife, um eine Schleife der M.marinum-Bakterienmasse aseptisch in den Kolben zu übertragen. Lassen Sie die Kappe locker oder verwenden Sie eine Filterkappe, um einen ausreichenden Gasaustausch und eine ausreichende Kultur bei 29 Grad Celsius im Dunkeln zu ermöglichen, ohne drei bis vier Tage zu zittern, bis die OD600 etwa 0,7 erreicht.
Verdünnen und weiter Kultivieren der Bakterien, wie im Text beschrieben. Um mit der Vorbereitung der bakteriellen Lösung für eine Infektion zu beginnen, übertragen Sie einen Milliliter der Kultur in eine frische Röhre. Zentrifuge bei 10.000 g für drei Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter sterilen PBS wieder auf. Mit sterilem PBS mit einem 0,3 Milligramm pro Milliliter Phenolrot als Tracer, verdünnen Sie die Suspension, um die gewünschte bakterielle Konzentration zu erreichen. Danach verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Suspension langsam durch eine 27-Spur-Nadel dreimal zu ziehen.
Führen Sie diesen Schritt kurz vor der Verwendung für jedes Aliquot aus. Zuerst pipette ein fünf Mikroliter Tröpfchen der verdünnten bakteriellen Lösung auf ein Stück Paraffinfolie. Ziehen Sie dann das Tröpfchen in eine 30 Gauge Insulinnadel.
Verwenden Sie einen fünf bis acht Monate alten Fisch für dieses Experiment, wobei der eine ein wilder Fisch und der andere ein Lappen-Mutantfisch ist. Positionieren Sie diese Fisch-Ventralseite in den Schlitzen eines Stücks feuchtem geschäumten Kunststoffs. Injizieren Sie die Insulinnadel zwischen den Beckenflossen in einem 45-Grad-Winkel.
Halten Sie die Nadelöffnung nach oben, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Öffnung in der Bauchhöhle befindet. Dann, langsam injizieren Sie die bakterielle Lösung. Danach entfernen Sie vorsichtig die Nadel und übertragen Sie den Fisch sofort in einen mit frischem Tankwasser gefüllten Bergungstank.
Nehmen Sie Proben aus dem bakteriellen Aliquot, der alle 15 Minuten auf 7H10-Platten verwendet wird. Inkubieren Sie diese Proben bei 29 Grad Celsius für fünf Tage, um die Infektionsdosis zu überprüfen. Überprüfen Sie regelmäßig das Wohlbefinden der Fische, um alle Fische mit Infektionssymptomen einzuschläfern, indem Sie sie in Wasser mit mehr als 0,02% von 3-Aminobenzoesäure-Ethylester inkubieren.
Nach der Einschläferne der Fische, legen Sie eine Stecknadel nach der Hintere zu den Zweigiostegal-Strahlen. Legen Sie einen zweiten Stift durch den Schwanz, um den Fisch auf die Plattform zu heften. Öffnen Sie mit einem Skalpell die gesamte Bauchhöhle.
Dann verwenden Sie einen kleinen Löffel und scharf-ended Pinzette, um die inneren Organe zu sammeln, die am Herzen beginnen und entlang der Wirbelsäule in Richtung des Schwanzes arbeiten, um alle inneren Organe in einem Block zu lösen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Darmnetz von der Kloake zu lösen und die Organe in ein 1,5-Milliliter-Homogenisierungsrohr mit einem halben Dutzend 2,8-Millimeter-Keramikperlen zu übertragen. Legen Sie die Röhre sofort auf Trockeneis, um die Probe einzufrieren.
Bewahren Sie die Probe bei negativen 80 Grad Celsius auf, bis sie zur Homogenisierung bereit ist. Messen Sie nach dem Extrahieren der DNA und der RNA die mykobakteriellen Belastungen anhand der quantitativen PCR, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie werden erwachsene Zebrafische durch eine intraperitoneale Injektion mit M.marinum infiziert.
Eine hohe Infektionsdosis führt zu einer fortschreitenden Erkrankung, bei der die mykobakterielle Belastung weiter zunimmt, bis die durchschnittliche Belastung etwa fünf Millionen Bakterien erreicht, die letztlich die Fische töten. Eine niedrige Dosis hingegen führt zur Entwicklung eines Krankheitsspektrums, ähnlich dem bei humaner Tuberkulose mit progressiven, latenten, reaktivierten und sterilisierten Infektionen. In diesem Fall steigt die Belastung für vier Wochen weiter an, nach dem die Krankheit in den meisten Fischen einen stabilen Zustand erreicht.
Diese Daten zeigen, dass die anfängliche Anzahl von Mykobakterien, die verwendet werden, um den Fisch zu infizieren, eine entscheidende Determinante für den Ausgang der Infektion ist. Rag-mutierte Zebrafische sind in der Lage, das Wachstum von Mykobakterien ausreichend zu begrenzen, was zu höheren bakteriellen Belastungen und erhöhter Morbidität führt. Dies zeigt deutlich, wie wichtig adaptive Immunität bei der Kontrolle der mykobakteriellen Infektion ist.
Die Konzentrationen von Interleukin-4 sind in der Wildtypgruppe signifikant höher und zeigen, dass die adaptive Reaktion für die effiziente Einführung von Interleukin-4 erforderlich ist, aber für die Einführung von Interferon-Gamma nach einer mykobakteriellen Infektion entbehrlich ist. Dieses Protokoll ermöglicht die Entnahme von DNA und RNA aus derselben Probe, wodurch es möglich ist, die mykobakterielle Belastung der Probe mit Genexpressionsdaten sowohl des Wirts als auch der Bakterien zu kombinieren. Diese Technik kann mit der Verabreichung von Medikamenten oder Impfstoffkandidaten kombiniert werden, um ihre Wirkung auf die mykobakteriellen Belastungen und Immunantworten zu bewerten.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die lokalen Richtlinien für die persönliche Sicherheit und Abfallentsorgung zu befolgen, wenn man mit einem Erreger der Biosicherheitsstufe 2 arbeitet. Diese Technik ermöglicht es, sowohl aktive als auch latente Tuberkulose mit ruhenden Mykobakterien im Zebrafisch zu studieren, der ein ethisches in-vivo-Modell ist.
