Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da tuberculose, como qual é o papel das respostas imunes adaptativas e a patogênese desta doença multifatorial. A principal vantagem deste método de base nucleico de ácido é que tanto cargas bacterianas quanto níveis de expressão genética podem ser medidos a partir do mesmo indivíduo. Para iniciar este procedimento, cultura M.marinum em uma placa 7H10 como descrito no protocolo de texto.
Transfira 10 mililitros de meio 7H9 contendo enriquecimento ADC, polisorbato 80 e glicerol para um frasco de cultura celular. Em seguida, use um loop de inoculação de um microliter estéril para transferir asepticamente um loopful da massa bacteriana M.marinum para o frasco. Deixe a tampa solta ou use uma tampa de filtro para permitir a troca de gás e cultura suficientes a 29 graus Celsius no escuro sem tremer por três a quatro dias até que o OD600 atinja cerca de 0,7.
Diluir e continuar a culminar as bactérias como descrito no texto. Para começar a preparar a solução bacteriana para infecção, transfira um mililitro da cultura para um tubo fresco. Centrífuga a 10.000 g por três minutos.
Remova o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de PBS estéril. Utilizando PBS estéril com um mililitro de 0,3 miligramas por mililitro de vermelho fenol como rastreador, diluir a suspensão para atingir a concentração bacteriana desejada. Depois disso, use uma seringa de um mililitro para puxar lentamente a suspensão através de uma agulha calibre 27 três vezes.
Execute esta etapa um pouco antes de usar para cada alíquota. Primeiro, pipeta uma gotícula de cinco microliter da solução bacteriana diluída em um pedaço de filme de parafina. Em seguida, puxe a gota em uma agulha de insulina calibre 30.
Use um peixe de cinco a oito meses para este experimento, sendo um peixe selvagem e o outro sendo um peixe mutante de trapos. Posicione estes peixes do lado ventral para cima nas fendas de um pedaço de plástico espumoso úmido. Injete a agulha de insulina entre as barbatanas pélvicas em um ângulo de 45 graus.
Mantenha a agulha aberta para cima para garantir que toda a abertura esteja dentro da cavidade abdominal. Então, injete lentamente a solução bacteriana. Depois disso, remova cuidadosamente a agulha e transfira imediatamente o peixe para um tanque de recuperação cheio de água fresca do tanque.
Pegue amostras da alíquota bacteriana em uso a cada 15 minutos em placas 7H10. Incubar essas amostras a 29 graus Celsius durante cinco dias para verificar a dose de infecção. Verifique o bem-estar dos peixes regularmente, certificando-se de eutanásia qualquer peixe com sintomas de infecção incubando-os em água com mais de 0,02% de 3-aminobenzoicos ácido etil ester.
Depois de eutanásia do peixe, insira um pino posterior aos raios ramificaistegal. Insira um segundo pino através da cauda para colocar o peixe na plataforma. Usando um bisturi, abra toda a cavidade abdominal.
Em seguida, use uma colher pequena e pinças afiadas para coletar os órgãos internos começando pelo coração e trabalhando ao longo da coluna em direção à cauda para desprender todos os órgãos internos em um bloco. Use pinças para separar a rede intestinal da cloaca e transferir os órgãos para um tubo de homogeneização de 1,5 mililitro contendo meia dúzia de contas cerâmicos de 2,8 milímetros. Coloque imediatamente o tubo em gelo seco para congelar a amostra.
Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativo até ficar pronto para homogeneizar. Após extrair o DNA e o RNA, meça as cargas micobacterianas por PCR quantitativo, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, os zebrafish adultos são infectados com M.marinum por uma injeção intraperitoneal.
Uma alta dose de infecção é vista para levar a uma doença progressiva na qual a carga micobacteriana continua a aumentar até que a carga média atinja cerca de cinco milhões de bactérias, matando o peixe. Uma dose baixa, por outro lado, leva ao desenvolvimento de um espectro de doença semelhante ao observado na tuberculose humana com infecções progressivas, latentes, reativadas e esterilizadas. Neste caso, a carga continua aumentando por quatro semanas após a qual a doença atinge um estado estável na maioria dos peixes.
Esses dados revelam que o número inicial de micobactérias usadas para infectar o peixe é um determinante crítico para o resultado da infecção. Os zebrafish mutantes de trapos são vistos como incapazes de limitar suficientemente o crescimento das micobactérias levando a cargas bacterianas mais altas e maior morbidade. Isso demonstra claramente a importância da imunidade adaptativa no controle da infecção micobacteriana.
Os níveis de interleucina-4 são significativamente mais elevados no grupo do tipo selvagem revelando que a resposta adaptativa é necessária para a introdução eficiente da interleucina-4, mas dispensável para a introdução de interferon gama após infecção micobacteriana. Este protocolo permite a coleta de DNA e RNA da mesma amostra, o que torna possível combinar a carga micobacteriana da amostra com dados de expressão genética tanto do hospedeiro quanto da bactéria. Esta técnica pode ser combinada com a administração de medicamentos ou candidatos à vacina para avaliar seu efeito sobre as cargas micobacterianas e respostas imunológicas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de seguir as diretrizes locais para segurança pessoal e descarte de resíduos ao trabalhar com um patógeno de nível dois de biossegurança. Essa técnica permite estudar tuberculose ativa e latente com micobactérias dormentes no zebrafish, que é um modelo in vivo ético não-mamífero.
