يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السل مثل ما هو دور الاستجابات المناعية التكيفية والعوامل المسببة للمرض من هذا المرض متعدد العوامل. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة قاعدة حمض نووي هو أن كل من الأحمال البكتيرية ومستويات التعبير الجيني يمكن قياسها من نفس الفرد. لبدء هذا الإجراء، الثقافة M.marinum على لوحة 7H10 كما هو موضح في بروتوكول النص.
نقل 10 ملليلترات من 7H9 المتوسطة التي تحتوي على تخصيب ADC، polysorbate 80، والجلسرين إلى قارورة ثقافة الخلية. ثم، استخدام حلقة تطعيم ميكروليتر واحدة عقيمة لنقل اخصوم واحد loopful من كتلة البكتيريا M.marinum في القارورة. اترك الغطاء فضفاضًا أو استخدم غطاء فلتر للسماح بتبادل الغاز الكافي وثقافته عند 29 درجة مئوية في الظلام دون أن تهتز لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى يصل OD600 إلى حوالي 0.7.
تمييع ومواصلة زراعة البكتيريا على النحو المبين في النص. للبدء في إعداد الحل البكتيري للعدوى ، قم بنقل ملليلتر واحد من الثقافة إلى أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي عند 10,000 غرام لمدة ثلاث دقائق.
إزالة عظمى وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة. باستخدام برنامج تلفزيوني معقمة مع 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر من الفينول الأحمر كمتتبع، وتمييع التعليق للوصول إلى التركيز البكتيري المطلوب. بعد هذا، استخدم حقنة ملليلتر واحدة لسحب التعليق ببطء من خلال إبرة قياس 27 ثلاث مرات.
تنفيذ هذه الخطوة فقط قبل استخدامها لكل aliquot. أولا، ماصة خمس قطرات ميكرولتر من الحل البكتيري المخفف على قطعة من فيلم البارافين. ثم، سحب قطرة إلى إبرة الأنسولين قياس 30.
استخدام سمكة عمرها خمسة إلى ثمانية أشهر لهذه التجربة مع واحد يجري الأسماك من النوع البري والآخر يجري خرقة الأسماك المتحولة. ضع هذه الأسماك الجانب البطني في الشقوق من قطعة من البلاستيك الرطب الرغوية. حقن إبرة الأنسولين بين زعانف الحوض في زاوية 45 درجة.
الحفاظ على إبرة فتح صعودا لضمان أن الفتحة بأكملها داخل تجويف البطن. ثم، حقن ببطء المحلل البكتيري. بعد ذلك، قم بإزالة الإبرة بعناية ونقل الأسماك على الفور إلى خزان استعادة مملوءة بمياه الخزانات العذبة.
أخذ عينات من aliquot البكتيرية في استخدام كل 15 دقيقة على 7H10 لوحات. احتضان هذه العينات في 29 درجة مئوية لمدة خمسة أيام للتحقق من جرعة العدوى. تحقق من رفاهية الأسماك بانتظام، والتأكد من القتل الرحيم أي الأسماك مع أعراض العدوى عن طريق احتضان لهم في الماء مع أكثر من 0.02٪ من 3-أمينوبنزويك حمض الإيثيل استر.
بعد القتل الرحيم الأسماك، إدراج دبوس الخلفي للأشعة برانتيوستيغال. إدراج دبوس الثاني من خلال الذيل إلى تك السمك على منصة. باستخدام مشرط، افتح تجويف البطن بأكمله.
ثم، استخدام ملعقة صغيرة وملاقط حادة النهاية لجمع الأجهزة الداخلية بدءا من القلب والعمل على طول العمود الفقري نحو الذيل لفصل جميع الأعضاء الداخلية في كتلة واحدة. استخدام ملاقط لفصل شبكة الأمعاء من كلواكا ونقل الأعضاء إلى أنبوب التجانس 1.5 ملليلتر تحتوي على نصف دزينة من الخرز السيراميك 2.8 ملليمتر. ضع الأنبوب على الفور على الثلج الجاف لتجميد العينة.
تخزين العينة في درجة مئوية سلبية 80 حتى تصبح جاهزة لتجانس. بعد استخراج الحمض النووي والرنا، وقياس الأحمال الفطرية بواسطة PCR الكمية كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يصاب حمار وحشي بالغ مع M.marinum عن طريق حقن داخل الصفاق.
وينظر إلى جرعة عالية من العدوى تؤدي إلى مرض التدريجي الذي الحمل الفطرية لا تزال في ازدياد حتى الحمل المتوسط يصل إلى حوالي خمسة ملايين بكتيريا في نهاية المطاف قتل الأسماك. جرعة منخفضة من ناحية أخرى يؤدي إلى تطوير طيف المرض مماثلة لتلك التي ينظر إليها في السل البشري مع تقدمية, كامنة, إعادة تنشيط, وتعقيم العدوى. في هذه الحالة ، يستمر الحمل في الزيادة لمدة أربعة أسابيع بعدها يصل المرض إلى حالة ثابتة في غالبية الأسماك.
وتكشف هذه البيانات أن العدد الأولي من البكتيريا المفطرة المستخدمة لإصابة الأسماك هو محدد حاسم لنتائج العدوى. وينظر إلى حمار وحشي متحولة خرقة لتكون قادرة على الحد بشكل كاف من نمو البكتيريا الفطرية مما يؤدي إلى ارتفاع الأحمال البكتيرية وزيادة المراضة. وهذا يدل بوضوح على أهمية مناعة التكيف في السيطرة على العدوى الفطرية.
مستويات إنترلوكين-4 هي أعلى بكثير في مجموعة نوع البرية تكشف عن أن الاستجابة التكيفية مطلوبة لإدخال الفعال من interleukin-4، ولكن يمكن الاستغناء عنها لإدخال إنترفيرون غاما بعد العدوى الفطرية. هذا البروتوكول يتيح جمع كل من الحمض النووي والرنا من نفس العينة مما يجعل من الممكن الجمع بين عبء mycobacterial للعينة مع بيانات التعبير الجيني لكل من المضيف والبكتيريا. ويمكن الجمع بين هذه التقنية مع إدارة الأدوية أو المرشحين للقاحات لتقييم تأثيرها على الأحمال الفطرية والاستجابات المناعية.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر اتباع المبادئ التوجيهية المحلية للسلامة الشخصية والتخلص من النفايات عند العمل مع عامل أمراض من المستوى الثاني للسلامة الحيوية. هذه التقنية يجعل من الممكن لدراسة كل من السل النشط والكامن مع mycobacteria نائمة في حمار وحشي الذي هو غير الثدييات الأخلاقية في نموذج vivo.
